Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Organ İzolasyonu
>NOT: Virüs oda sıcaklığında (RT) stabil değildir, bu nedenle viral titreleri korumak için bir seferde hasat edilen hayvan sayısı dikkatli bir şekilde planlanmalıdır.
- Gerekli fenotipe bağlı olarak seçilen dozu ve rotayı kullanarak fareleri enfekte edin. Bu protokol için, 8-10 haftalık erkek ve dişi tip I interferon reseptör eksikliği olan (Ifnar1-/-) C57BL / 6 fareleri enfekte edin.
- Ketamin (90 mg / kg) ve Xylazine (10 mg / kg) kokteyli ile Ifnar1-/- fareleri uyuşturun. Anesteziyi doğrulamak için pedal refleksini sıkı bir ayak parmağını sıkıştırarak test edin. 1 x 105 odak oluşturma birimi (FFU) ZIKV'yi 50 μL deri altından (SC) ayak pedi aracılığıyla uygulayın.
- Aletlerin dezenfeksiyonu için 50 mL'lik bir konik içinde 2 makas, forseps ve 20 mL %70 etanol (EtOH) ile hasat için gerekli tüm malzemeleri bir gün önceden hazırlayın.
- Şırıngaları ve iğneleri hazırlayın: perfüzyon için 20 mL'lik bir şırınga, 23 G'lik iğneler (kafes başına yaklaşık 1 adet) ve 25 G'lik iğneli 1 mL'lik şırınga (3-5 farede 1'i). Tüpleri tartmadan önce, 1,5 mL O-ring vidalı kapaklı tüplere (her organ için bir tane) çelik boncuklar (davlumbazda) ekleyin. Tüplerin homojenizasyona uygun olması gerekir.
- Hasat gününü, perfüzyon ve organ dondurma için gerekli malzemeleri hazırlayın.
- Buz banyosu yapmak için bir buz kovasını kuru buz ve% 70 EtOH ile doldurun. Her perfüzyon için PBS fare başına 25-30 mL, omurilik için 5-10 mL gerektiğini varsayarak steril fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın. Anestezi, bir Ketamin ve Xylazine kokteyli alın ve fare başına 300 μL varsayın. Akış sitometrisi vb. için gerekli tüm malzemeleri ve ek tüpleri, hayvan tesisine taşımak için ikincil bir kaba koyun.
- Hayvan barınağına giriş ve çıkış sırasında kişisel koruyucu ekipmanların giyilmesi ve çıkarılması da dahil olmak üzere giriş için gerekli tüm prosedürleri izleyin.
Dikkat: Tüm prosedürler, bir Biyogüvenlik seviye 2 laboratuvar (BSL-2) tesisi içinde sertifikalı bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilecektir.
- Hayvanın büyüklüğüne ve ağırlığına bağlı olarak intraperitoneal olarak 200-500 μL anestezi uygulayın. Tek başına çalışıyorsanız, organ toplamadan önce hayvanları öldürmekten kaçınmak için her seferinde bir hayvana anestezi uygulayın.
- Pedal refleksini değerlendirmek için ayak parmağını forseps ile sıkıştırarak anestezi dozunu onaylayın. Tamamen yanıt vermedikçe devam etmeyin. Fareyi bir balmumu tahtasına sabitlemek için pimleri kullanın. Bu noktada, organ toplama prosedüründe saç kontaminasyonunu önlemek için fareyi %70 etanol ile ıslatın.
- Kalp delinmesi ile ölümcül kanama.
- Makas ve forseps kullanarak, kalbi ortaya çıkarmak için hayvanı göğüs boşluğundan açın. Kalp ponksiyonu (~ 800 μL) yoluyla kan toplayın, bu, klinik kimya, hematoloji, antijene özgü yanıtları tespit etmek için akış sitometrisi ve viral kopya sayısının analizi için gerçek zamanlı kantitatif PCR (qRT-PCR) dahil olmak üzere çoklu testler için kullanılabilir.
- qRT-PCR ile viral RNA analizi için, kanı tam kandan çıkarılıyorsa bir EDTA tüpünde veya serumdan çıkarılıyorsa bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. (Serum için, tüpü bir santrifüjde maksimum hızda, oda sıcaklığında, 20 dakika döndürün ve serumu ayrı bir tüpe alın). Bitirdikten sonra serum örneğine taşıyıcı olarak doğrusal bir poliakrilamid ekleyin. RNA daha sonra daha sonraki bir tarihte işlenmek üzere -80 °C'de analiz edilebilir veya saklanabilir.
- 20 mL'lik şırıngayı oda sıcaklığında (veya 37 ° C) PBS ile doldurun ve kelebek iğneyi sol ventriküle sokarak fareleri perfüze edin. Kan ve PBS'nin çıkmasına izin vermek için sağ atriyumu delin. Hayvanın tamamen perfüze olduğunu doğrulamak için karaciğerin rengini kontrol ederken PBS'yi yavaşça uygulayın. Karaciğer koyu kırmızıdan pembe somon rengine değişmelidir.
- Organları histoloji için hazırlıyorsanız, kelebek iğneyi yerinde bırakın ve ardından 20 mL buz gibi% 4 paraformaldehit ile perfüze edin. Eğer öyleyse, şırınganın her iki şırınga da bağlı olarak 3 bir musluka bağlanması, PBS ve PFA arasında bir alternatif olarak valfi AÇIK ve KAPALI konuma getirmesi uygundur.
- Organları etiketli, tartılmış tüplere hasat edin. Periferik organlar için, hasat için belirlenmiş bir sırayı izleyin: karaciğer, dalak, böbrek ve akciğerler.
- Karaciğerden sadece bir lob alın; hangisi olduğu önemli değil, ama tüm deneyler için her zaman aynı lobu aynı büyüklükte bir parça ile almaya çalışın. Benzer şekilde, böbrekler ve akciğerler için aynı böbrek ve akciğeri alın. Akım sitometrisi de tamamlanacaksa, herhangi bir organ ikiye bölünebilir. Sitometri için kullanılacak yarısını, hasat tamamlanana kadar oda sıcaklığında Roswell Park Memorial Institute besiyerinde (RPMI) saklayın.
- Hasattan hemen sonra, her organı etiketli bir tüpe koyun ve kuru buz banyosuna koyun. Virüs titresi oda sıcaklığında zamanla azalır, bu nedenle organların toplanması için geçen süre son derece önemlidir. Fareler arasında tutarlılık olmalıdır, bu nedenle güvenlikten sonra bir sonraki öncelik hızdır.
not: Viral titreler için organlar toplanıyorsa, viral titreleri korumak için bu noktada ikinci bir bireyin beyni hasat etmesi çok yararlıdır.
- Omurgaya ve kafatasına erişmek için kalan organları fare gövdesi boşluğundan çıkarın.
- Fareyi tahtadan çıkarın ve postu çıkarın, ardından kolları ve bacakları çıkarın.
Kafatasını foramen magnumdan tırtıklı LaGrange makasıyla keserek beyni hasat etmek için kafa kesme, künt veya cerrahi makasla farenin kafasını çıkarın. Daha sonra forseps ile kafatasını soyun ve bir spatula ile beyni çıkarın.
- Güçlü, körelmiş makas kullanarak omurgayı çevreleyen kaburgaları ve diğer kemikleri çıkarın. Ardından, pelvik kemiği kesin ve vertebral foramen'i bel seviyesinde açığa çıkarın. Omuriliğin küçük ucu bu noktada görünür olmalıdır.
- PBS ile doldurulmuş 10 mL'lik bir şırınga ve 18 G'lik bir iğne kullanarak, kordonu bir Petri kabı üzerinde lomberden servikal omurgaya "aklayarak" omuriliği dışarı atın.
- İğnenin omur gövdesine girmesini önlemek için aşırı basınçtan kaçınarak iğnenin eğimli ucunu omur forameninin içine dikkatlice yerleştirin. Omur gövdesine ve iğneye baskı uygulamak için kuvvetlice tutun ve kordonu çıkarmak için şırınga pistonuna bastırın. Omuriliği hemen etiketli tüpe aktarın ve kuru buz banyosuna yerleştirin.
- Hasat tamamlanana kadar işlemi tüm hayvanlarla tekrarlayın. Hasat aletlerini hayvanlar arasındaki% 70 etanolün içine yerleştirin. Tutarlılık ve hıza odaklanın. Viral titre sonuçlarını önyargılı hale getirmemek için her organ hasadı arasındaki süre tutarlı kalmalıdır.
- Bittiğinde, hayvan tesisinden çıkarmadan önce biyogüvenlik kabinini ve tüm malzemeleri dezenfekte edin.
- Her bir tüpü buz banyosundan çıkarın ve organ ağırlığını belirlemek için tüpleri tartın. Organların ağırlığını belirlemek için, boş tüpün ağırlığını organ içeren tüpün ağırlığından çıkarın.
NOT: Bu noktada, organlar daha sonraki bir tarihte daha fazla işlem yapmak için -80 ° C'de dondurulabilir veya organlar, tek tek alikotlar dondurulmadan hemen önce homojenize edilebilir. Örneklerin birden çok kez dondurularak çözülmesi viral titreyi azaltır. Bu nedenle, tek bir projedeki tüm deneyler için aynı prosedürü yapmak önemlidir.
2. Organ Homojenizasyonu
- Homojenize edilecek her organ için 3 adet etiketli, 1,5 mL geçmeli kapaklı tüp hazırlayın.
- Numuneler hasattan hemen sonra homojenize edilmiyorsa, tüpleri -80 °C'den çıkarın. Numunelerin homojenize edilmesi için çözdürülmesine gerek yoktur.
- Viral titre kaybını en aza indirmek için numuneleri soğuk tutmak için buzun üzerine koyun. Daha sonra, organ içeren her tüpe% 5 FBS içeren 1 mL soğuk DMEM ekleyin.
- Üreticinin talimatlarına göre tüpleri hemen bir boncuk çırpıcıda çırpın. Tüm organları bir boncuk homojenizatör aletinde çelik boncuklarla homojenize edin. Her organın tamamen homojenize edildiğinden emin olmak için kontrol edin.
- Organ kalıntılarını 12,000 ° C'ye soğutulmuş bir mikrofüje 5 dakika boyunca 8 x g'da bir mikrofugede döndürün. Ardından tüpleri buz kovasına geri koyun. Biyogüvenlik kabininde, gerekli tahliller için numuneleri tüplere alın. Ardından tüpleri buz kovasına geri koyun.
- Odak oluşturma tahlili için, etiketli bir tüpe 500 μL'yi alikotlayın. Ardından tüpleri bir buz kovasının üzerindeki rafa yerleştirin. Viral genom kopya sayısını ölçmek için florojenik kantitatif RT-PCR (qRT-PCR) için RNA için bir tüpe 50 μL ekleyin.
- Ticari bir RNA izolasyon kiti kullanarak enfekte hayvanların organlarından toplam RNA'yı izole edin. Her flavivirüs genomundaki benzersiz dizileri tanıyan ZIKV'ye özgü primer-prob setlerini kullanarak flavivirüs viral RNA'sını belirleyin. ZIKV hedef dizilerini içeren T7 polimeraz kullanılarak in vitro olarak oluşturulan tanımlanmış bir pozitif tek sarmallı RNA içeren bir kopya kontrol plazmidi kullanarak viral kopya sayısını belirleyin.
- Yaklaşık 300 μL olan kalan numuneyi üçüncü tüpe alın ve gerekirse -80 °C'de saklayın.
NOT: Numuneler daha önce dondurulmamışsa, -80 °C'de dondurun. Numuneler daha önce dondurulmuşsa, durdurmadan önce odak oluşturma tahlili ve/veya RNA izolasyonuna devam edin.
3. Zika Virüsü Odak Oluşturma Testi
NOT: Virüs içermeyen bir kontrol ve pozitif bir kontrol eklemek önemlidir. Pozitif kontrol, bilinen bir konsantrasyona sahip bir virüs stoğunun seyreltme serisidir. Tüm kontrollerin aynı plaka üzerinde olması gerekmez, ancak tahlil 5 plakadan daha büyük hale geldikçe, daha fazla kontrol eklenmeli ve plakalar arasında yayılmalıdır. Tek tabakayı pipet uçlarıyla veya kuvvetli yıkama ile çizmemeye dikkat edin. Aynı gün veya farklı günlerde birden fazla organ titrelenebilir. Bununla birlikte, tek bir organ birkaç gün boyunca titre edilmemelidir, çünkü farklı tahlil koşulları viral titreyi etkileyebilir. Tek bir organın tek bir günde çalıştırılması şiddetle tavsiye edilir.
- Tahlil gününden önce, odak oluşturan tahlil için gerekli hücreleri ve reaktifleri hazırlayın.
- 5 mL HEPES ve 25 mL FBS ile 500 mL DMEM içeren büyüme ortamı hazırlayın. Testin başlamasından önce Vero-Dünya Sağlık Örgütü (WHO) hücrelerinin 37 ° C,% 5 CO2 'de büyüme ortamında büyümesine sahip olun. Vero hücreleri, testin başlamasından önce yüksek bir geçit olmamalı veya hiç %100'ün üzerinde birleşmemelidir.
- 1 L'lik bir cam ortam şişesini 10 g metilselüloz ve büyük bir karıştırma çubuğu ve 500 mL H2O içeren ayrı bir 1 L cam ortam şişesini otoklavlayarak 500 mL'lik bir %2'lik metilselüloz çözeltisi hazırlayın. Otoklavlanmış su soğuduysa, şişe dokunulamayacak kadar sıcak olana kadar mikrodalgada tekrar ısıtın, ancak kaynamayın.
- Doku kültürü davlumbazındayken bir şişe metilselüloza nazikçe ılık/sıcak su dökün. Şişeyi kısmen kapatın ve metilselüloz çözelti içine girene kadar (1-4 saat) ocak gözü üzerinde karıştırın. % 2'lik metilselüloz çözeltisini steril 50 mL'lik konik bir tüpe alın. %2 Metilselüloz ihtiyaç duyulana kadar 4 °C'de saklanabilir.
- Plakaları sabitlemek için PBS'de% 5'lik bir Paraformaldehit çözeltisi hazırlayın ve ihtiyaç duyulana kadar 4 ° C'de saklayın. PBS'ye% 0.05 Triton X-100 ekleyerek 1x odak oluşturan bir tahlil yıkama tamponu hazırlayın ve RT'de saklayın. PBS'ye 1 mg / mL saponin ekleyerek 1x FFA boyama tamponu hazırlayın ve ihtiyaç duyulana kadar 4 ° C'de saklayın. Bunlar bir ila iki hafta önceden hazırlanabilir.
- Tahlil için gerekli olan düz tabanlı 96 oyuklu plakanın sayısını, her bir organ üç kopya halinde kaplanacak şekilde hesaplayın. Pozitif ve negatif kontroller için yeterli ek kuyu ekleyin.
- Tasarlanan testi tamamlamak için büyüme ortamında yeterli Vero hücresi büyütün. Vero hücrelerini tripsinize edin ve bunları sayın, büyüme ortamında mL başına 1.5 x 105 hücrede yeniden süspanse edin. Plaka Vero hücreleri 96 kuyulu düz tabanlı plakalarda 3.0 x 104 Vero-WHO hücresi / kuyuda kuyu başına 200 μL ekleyerek büyüme ortamında.
- Plakaları gece boyunca% 5 CO2'de 37 ° C'de inkübe edin, hücrelerin kuyu içinde eşit olarak dağılması için plakaların inkübatörde düz olduğundan emin olun.
NOT: Her laboratuvar Vero hücrelerini biraz farklı şekilde büyütür; Hedef, Zika virüsü için tahlil gününde her kuyucukta% 90-95 birleşik tek tabakadır.
- Tahlil gününde Zika virüsü örneklerini seyreltin. Organ numuneleri daha önce homojenize edilmişse, numuneleri -80 °C dondurucudan çıkarın ve numuneleri tahlil için buz üzerine koymadan önce çözülmelerine izin verin.
- Buz üzerinde, B'den H'ye kadar olan sıralara 96 μL soğuk büyüme ortamı ekleyerek yuvarlak tabanlı 180 oyuklu bir plaka hazırlayın ve A satırını boş bırakın. Her homojenize organ örneğinden 150 μL'yi yuvarlak alt plakanın A sırasına ekleyin.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak her numunenin 10 kat seri seyreltmelerini hazırlayın. Numuneleri, 180 μL büyüme ortamına 20 μL numune ekleyerek, her seyreltme arasında pipet uçlarını değiştirerek yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakada seyreltin.
- Vero hücrelerini kaplayan düz tabanlı 96 oyuklu plakadan ortamı çıkararak odak oluşturma plakasını hazırlayın. Tek tabakanın kurumasını önlemek için virüs örneklerini eklemeden hemen önce bunu yapın.
- Vero plakasındaki her oyuğa 100 μL virüs seyreltmesi ekleyin. En düşük konsantrasyondan en yüksek konsantrasyona doğru ilerleyerek aynı uç setini kullanarak bir numune ekleyin. Kaya plakaları 2-4 kez yan yana dönmemeye dikkat edin.
- 37 °C'de,% 5 CO2'de 1-2 saat inkübe edin. Plakaların inkübatör içinde düz olduğundan emin olun. Kuluçka sırasında% 2 metilselülozu RT'ye ısıtın.
- % 2'lik metilselüloz çözeltisini büyüme ortamında seyreltin. Seyreltme, büyüme ortamına yaklaşık %2 metilselülozun %2: 1'i oranında olmalıdır. Kullanma zamanı gelene kadar oda sıcaklığında tutun. 1-2 damla / kuyu (pipeti 125 μL'ye ayarlayın) metilselüloz ekleyin: 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna büyüme ortamı.
- 32-40 saat 37 ° C'de,% 5 CO2'de inkübe edin. Herkesin Vero hücreleri biraz farklı şekilde büyüdükçe ve hücre birleşmesi ve Zika virüsünün suşu gibi faktörler kuluçka süresini değiştirebilir.
- Hazırlanan% 5 paraformaldehit çözeltisini kullanarak Vero hücrelerini sabitleyin.
- Biyogüvenlik kabinindeki metilselüloz tabakasının üst kısmına her bir kuyucuğa 50 μL %5 paraformaldehit ekleyin. RT'de 60 dakika inkübe edin. Sabitleme gece boyunca 4 °C'de gidebilir, ancak buharlaşmayı azaltmak için plakayı parafilm ile kaplayabilir.
- Hücreleri ve medyayı biyogüvenlik kabininin içindeki bir atık kabına boşaltın. PBS, 150 μL / kuyu ile nazikçe yıkayın. PBS'yi plakalardan çıkarın ve plakayı BSL-2'den çıkarın.
- PBS yıkamasını 2x 150 μL / kuyucuk ekleyerek tekrarlayın. Ardından PBS'yi çıkarın. 150 μL / kuyu 1x FFA yıkama tamponu ekleyin ve sabit hücrelere nüfuz etmesi için RT'de 5-10 dakika bekletin.
- Birincil Zika antikoru kullanarak enfeksiyonu tespit edin. Birincil antikor 4G2'yi (D1-4G2-4-15) FFA boyama tamponunda 1 μg / mL konsantrasyonda hazırlayın. Tüm test için yeterli antikor hazırlayın.
not: Lifler odakların görüntülenmesini olumsuz etkileyeceğinden, laboratuvar bezlerinden veya diğer yüksek tüy bırakan emici malzemelerden uzak durun.
- FFA yıkama tamponunu plakalardan çıkarın. FFA boyama tamponuna 50 μL / kuyu primer antikor ekleyin. Plakaları parafilm ile kapatın ve sallanan bir platform üzerinde gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Test, RT'de 2 saat boyunca bir inkübasyon ile yapılabilir.
- İkincil bir HRP konjuge antikorun eklenmesiyle enfeksiyonu görselleştirin. İkincil Keçi anti-fare HRP etiketli antikoru FFA boyama tamponunda 1: 5.000 konsantrasyonda hazırlayın. Tüm test için yeterli antikor hazırlayın.
- Hücreleri FFA yıkama tamponu ile 3 kez yıkayın, yıkama tamponunu her seferinde lavaboya iterek çıkarın. Hücreleri 50 μL / kuyuda FFA boyama tamponunda ikincil antikor ile boyayın. RT'de 1-2 saat inkübe edin.
- Hücreleri FFA yıkama tamponu ile 3 kez yıkayın, yıkama tamponunu her seferinde lavaboya iterek çıkarın. 50 μL/kuyucuk Trueblue Substrat ekleyin.
- Plakaları dikkatlice izleyin, noktalar tam olarak tanımlanana ve minimum arka plan olana kadar 2-15 dakika bekleyin. Lekeler göründükten sonra, tek tabakayı akan suyun kuvvetinden korumak için bir elinizi kullanarak suyla nazikçe yıkayın. Kağıt havluların üzerine (ÇOCUK BEZİ DEĞİL) hafifçe vurarak kurulayın ve mümkün olan en kısa sürede görüntüyü alın.
- Spotlar manuel olarak veya otomatik bir spot sayacı kullanılarak sayılabilir. Manuel olarak sayılırsa, görselleştirmeye yardımcı olmak için bir diseksiyon kapsamı kullanılabilir.
- Her numune için, kolayca ayırt edilebilen odaklarla (örneğin, oyuk başına 20 ila 200) bir seyreltme seçin ve mükerrer kuyucukların ortalamasını kullanarak mL başına odak oluşturan birimlerde (FFU/ml) titreyi hesaplayın: FFU/mL = (ortalama odaklar/kuyucuk) × (seyreltme faktörü) ÷ (mL aşı).
