Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Kan Alımı ve Trombosit İzolasyonu
- Deney gününde veniponksiyon yoluyla rıza gösteren sağlıklı yetişkin donörlerden insan kanını% 3.8 trisodyum sitrat haline getirin. Trombosit sayıları μL başına 250 x 103'ye yakın olan donörlerde 20-25 koşul için yeterli trombositten zengin plazma (PRP) elde etmek için 4,5 mL'lik bir tüp kan yeterlidir.
NOT: Dar iğnelerle (21 G'den küçük) kan almaktan kaçının.
- PRP'yi 22 °C'de ve 140 x g sıcaklıkta uzun bir frenle 12 dakika santrifüjleme yoluyla hazırlayın. Bu, altta kırmızı kan hücreleri ve üstte açık renkli PRP olmak üzere iki farklı katmanla sonuçlanacaktır.
- 45° açıyla kesilmiş bir pipet ucundan dikkatli bir pipetleme yoluyla PRP'nin üst, bulanık, sarı tabakasını izole edin ve tam kan sayımı (CBC) yoluyla trombosit sayısını elde edin.
- Gerekirse, trombositleri prostaglandin E1 (PGE1) varlığında 1,4-Piperazindietansülfonik asit sodyum tuzu (PIPES) tamponlu salin (150 mM sodyum klorür, NaCl, 20 mM PIPES) içinde yıkayın ve Tyrode tamponunda (134 mM NaCl, 0.34 mM di-sodyum hidrojen fosfat, Na2HPO4, 2.9 mM potasyum klorür, KCl, 1 mM magnezyum klorür, MgCl2, 5 mM glikoz, 12 mM sodyum bikarbonat, NaHCO3, 20 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit, HEPES, pH 7.35) 5 mM glikoz ile, aksi takdirde adım 1.5'e geçin. Aşağıdaki adımlar yıkamayı kısaca açıklamaktadır.
- PIPES tamponlu salin ile PRP hacmini 10 mL'ye ayarlayın ve 0,6 μM PGE1 ekleyin.
- 1.900 x g'de 8 dakika santrifüjleyin, ardından süpernatanı atın ve trombosit peletinin 400 μL Tyrode ve glikoz çözeltisinde 5 dakika bekletin.
- Trombosit peletini nazikçe yeniden süspanse edin ve 30 dakika boyunca rahatsız edilmeden tutun.
- Trombosit sayısını, havuzlanmış insan trombositinden fakir plazma (PPP) ile μL başına ~ 250 x 103 trombosit olarak ayarlayın ve süspansiyonu 22 ° C'de bozulmadan veya hafif rotasyon altında tutun.
2. Antikor ve üniform kesme tedavisi
NOT: Bölüm 2'de pipetleme gerektiren tüm adımlar, herhangi bir kesme işlemi yapmamak için yavaşça yapılmalıdır.
- İstenilen antikoru PRP'ye veya yıkanmış trombositlere ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek veya bir pipet ucu ile karıştırarak nazikçe karıştırın. Oda sıcaklığında 5-10 dakika rahatsız edilmeden bırakın. Negatif bir kontrole eşdeğer hacimde PPP veya Tyrode arabelleği ekleyin.
- Koni plakalı viskozimetreyi açın, plaka sıcaklığını 22 °C'ye ayarlayın ve plakanın bu sıcaklığa ulaşması için zaman tanıyın.
- İşlem görmüş PRP'yi veya yıkanmış trombositleri doğrudan plakanın ortasındaki sıcaklık kontrollü konik plaka viskozimetresine pipetleyin. Numunenin tamamının, koninin kenarının dışında değil, temas noktasında koni ile plaka arasında biriktiğinden emin olun.
- Uygun bir hızda ve sürede kesin.
- Kesmeyi, viskozimetre kılavuzunda belirtildiği gibi veya daha önce gösterildiği gibi hesaplayın.
- Newton'un viskozite yasası ile viskoziteden kesme hızını ve istenen kesme gerilimini belirleyin;
; plazma viskozitesi 1.5-1.6 centipoise (cP) 'dir. Örneğin, insan dolaşımı için normal bir kesme aralığı 5-30 dyn/cm2'dir ve kesme işlemi tek basamaklı dakika zaman ölçeğinde uygulanmalıdır.
- Numunenin hem plaka hem de koni ile temas halinde kalması için koniyi plakadan hafifçe kaldırın (~2 mm) ve numune hacminin merkezinden 5-10 μL toplamak için jel yüklemeli veya başka bir uzun pipet ucu kullanın.
- Kesilmiş numuneleri istenen işaretleyicilerle oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Fosfatidilserin, β-galaktoz ve P-selektin maruziyeti belirteçleri için sırasıyla 0.08 μM'de Lactadherin C2 alanı (LactC2), 6.25 μg/mL'de Erythrina cristagalli lektin (ECL) ve anti-P-selektin antikoru (20 μg/mL) kullanın.
- Seyreltme veya soğuk depolamadan önce numuneleri RT'de 20 dakika boyunca %2 paraformaldehit içinde sabitleyin ve adım 3.1'e geçin veya numuneleri 4 °C'de 12 saatten daha uzun süre saklayın.
3. Yüzey işaretleyicilerinin tespiti ve akış sitometrisi
ile
çapraz bağlama
- Numuneyi akış sitometrisi yoluyla analiz edin ve her koşul için en az 20.000 olay toplayın.
- Her bir floroforun yoğunluğu için yükseklik değerini veya geometrik ortalama floresan yoğunluğunu (MFI) kullanarak floresan işaretleyicilerin sinyal gücünü ölçün.
- Kesme işleminden sonra trombosit çapraz bağlanmasını tespit etmeyi hedefliyorsanız, numuneyi görüntüleme özellikli bir akış sitometresinde analiz edin ve alan ve en-boy oranı parametrelerine göre çapraz bağlamayı ölçün.
- Alan ve/veya en boy oranının histogramını çizin.
- Sığır serum albümini (BSA) veya araç ile negatif bir kontrol kullanarak, en tam dairesel olayları dışlayan bir kapı çizin (bu kapı genellikle ~ 0.8 en boy oranında çizilir) ve bu kapının içindeki olayların yüzdesini ölçün. Daha düşük en boy oranına sahip etkinliklerin çapraz bağlantılı olma olasılığı daha yüksektir.
