>1. BMM'lerin Enfeksiyon için Lameller Üzerine Kaplanması
- Her boş kuyucuğun dibine dört (4) adet steril 12 mm cam lamel (otoklavlanmış ve kapalı bir cam kapta saklanmış) yerleştirerek 6 oyuklu doku kültürü plakaları hazırlayın.
not: Her bir steril 12 mm'lik lamel içini, bir vakum hattına takılan bir aspirasyon ucu ile alın. Lamelleri üst üste binmeden kuyucuklara yerleştirin ve vakumu kesmek için boruyu sıkıştırarak istenen konumda serbest bırakın.
- Yapışık kemik iliği türevi makrofajlarla kaplanmış Petri kaplarından aspire ortamını (ve yapışık olmayan hücreleri) aspire edin ve yapışık hücreleri 2x, önceden 37 °C'ye ısıtılmış kalsiyum ve magnezyum klorür (PBS -/-) içermeyen steril Dulbecco'nun Fosfat tamponlu salin ile nazikçe durulayın.
- Her Petri kabına damla damla, 5 mL steril 1x PBS -/- ekleyin ve 1 mM EDTA'lık bir son konsantrasyon ile ekleyin ve yapışan BMM'leri ayırmak için 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Hücrelerin bir mikroskop kullanarak ayrıldığını doğrulayın.
- 50 mL'lik konik bir tüpte 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile desteklenmiş 1x PBS'de asılı tüm müstakil hücreleri toplayın. Her kabı 2 kez 5 mL PBS -/- ile durulayın ve hücre süspansiyon havuzuna ekleyin.
not: Hücre süspansiyonu, toplama işlemi sırasında makrofajları EDTA toksisitesinden korumak için ek PBS -/- ile seyreltilebilir.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve makrofajları pipetleme ile 5 - 10 mL BMM ortamında yeniden süspanse edin. Tüplere yapışmasını ve topaklanmasını önlemek için yeniden askıya alınmış hücreleri buzun üzerine yerleştirin.
- Hemositometrede Tripan mavisi dışlamasını kullanarak canlı hücreleri sayın.
not: 5 mL ortamda yeniden süspanse edilen BMM hücrelerini saymak için, 445 μL PBS -/- ve 30 μL% 0.4 Tripan mavisi çözeltisinde 25 μL hücre süspansiyonunun bir seyreltme karışımı tipik olarak bir hemositometrede kolay miktar tayinine izin verir (son hesaplama için 20x seyreltme faktörü dikkate alınarak). Yalnızca Tripan mavisi (canlı hücreler) ile lekelenmemiş hücreleri sayın. Bu karışım çok konsantre veya seyreltilmişse hücre süspansiyonunun hacmi değişebilir. Genel olarak, preparat başına BMM verimi, tek bir fareden 2 x 107 ve 5 x 107 hücre arasında değişir.
- Hücre süspansiyonunu BMM ortamında istenen kaplama konsantrasyonunda (5 x 105 / mL) hazırlayın ve süspansiyonu her bir kuyucuk 1 x 106 makrofaj alacak şekilde oyuk başına 2 mL ortamda 6 oyuklu plakaya dağıtın.
not: Bu, her kuyucuğun lamelleri düzgün bir şekilde kaplamak için yeterli sayıda makrofaj almasını sağlayan kritik bir adımdır. Kuyucuklardaki lamellerin üst üste binmediğini veya ortamda yüzmediğini kontrol edin. Eğer öyleyse, steril bir pipet ucuyla nazikçe ayarlayın.
- Gece boyunca 37 °C, %5 CO2'de inkübe edin.
2. L. amazonensis'in Enfektif Formlarının Saflaştırılması
NOT: Leishmania'yı enfeksiyonlar için hazırlayın - metasiklik promastigotları sabit promastigot kültürlerinden saflaştırın veya kültürdeki promastigotları standart L. amazonensis aksenik farklılaşma protokolünü kullanarak amastigot formuna ayırın.
- Leishmania metasiklik promastigotlarının yoğunluk gradyanlı ortam kullanılarak saflaştırılması (Malzemeler)
- Steril, endotoksin içermeyen suda% 40 yoğunluk gradyan ortamı stok çözeltisi hazırlayın.
- M199 ortamında% 10 konsantrasyon hazırlamak için yoğunluk gradyan çözeltisini 10x M199 ortamında (serumsuz) seyreltin.
- Tüm çözeltileri 0,22 μm filtreden geçirin.
not: Stok çözeltileri 4 °C'de karanlıkta 1 aydan fazla saklanamaz.
- 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpünün altına 2 mL %40 yoğunluk gradyan ortam çözeltisi ekleyin.
- M199'da %2 yoğunluk gradyan medya çözeltisinin 2 mL'lik %40 yoğunluklu gradyan medya çözeltisini, iki katman arasında herhangi bir karışımı önlemek için bir Pasteur pipeti kullanarak dikkatli bir şekilde yerleştirin.
- 10 dakika boyunca 1.900 x g'da santrifüjleme ile sabit faz kültüründen 1 x10 9 parazit toplayın.
- 6 mL Dulbecco'nun Modifiye Esansiyel Ortamında (DMEM) hücreleri yeniden askıya alın.
- Hücre süspansiyonunun 2 mL'lik katmanı, katmanlar arasında karışmayı önlemek için bir Pasteur pipeti kullanarak nazikçe% 10 yoğunluklu gradyan ortam katmanının üzerine.
- Degradeyi oda sıcaklığında 1.300 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
not: Leishmania türleri arasındaki fiziksel özelliklerdeki farklılıklar nedeniyle, maksimum verimi sağlamak için her biri için santrifüjleme koşullarının biraz ayarlanması gerekebilir.
- Üst %10 yoğunluk gradyan ortam sınırında (%0 ve %10 yoğunluklu gradyan ortam katmanları arasındaki arayüz) oluşan banttan parazitleri (metasiklik promastigot formunda zenginleştirilmiş) toplayın.
- Parazitleri bir hacim DMEM ile seyreltin ve santrifüjleme ile toplayın (oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.900 x g).
- 500 μL DMEM ortamında yeniden süspanse edin ve verimi ölçmek için bir hemositometrede sayın.
- Aksenik kültür koşulları altında (düşük pH / yüksek sıcaklık) L. amazonensis amastigotes üretimi.
- 5 mL log fazlı promastigot kültürünü (26 oC'de pH 7.4) eşit hacimde amastigot ortamı (pH 4.5) ile 25 cm2 şişe (toplam 10 mL ortam) kullanarak karıştırın ve gece boyunca 26 ° C'de inkübe edin.
- Şişeyi 26 °C'den 32 °C'ye kaydırın.
- 3 veya 4 gün sonra, kültürü 32 ° C'de amastigot ortamında 1: 5 oranında bölün.
- Enfeksiyonlarda kullanıma hazır olup olmadıklarını görmek için parazitleri önümüzdeki 3 - 4 gün içinde (en fazla 7 gün) kontrol edin.
not: Sağlıklı aksenik amastigotlar, görünür kamçı olmadan oval bir şekle sahip olmalıdır. Kısmen farklılaşmış amastigotlar, kısa kamçılı geniş oval bir şekle sahiptir. Kültürde çok fazla küme olmamalıdır - birçok küme, büyümeyen, ölmekte olan parazitlerin bir göstergesidir. Amastigot kültürü 1:5 oranında bölünebilir ve en fazla 3 hafta boyunca korunabilir.
3. L. amazonensis enfeksiyonu
- Parazit süspansiyonlarını istenen MOI'ye göre seyreltin (genellikle makrofaj başına 3-5 metasiklik promastigot [1:3 veya 1:5 MOI] ve makrofaj başına 1 amastigot [MOI 1:1]). Halihazırda 2 mL ortam içeren her bir oyuğa 50 - 100 μL'lik bir hacimde PBS -/- içinde Leishmania ekleyin.
- Enfeksiyon için BMM'leri amastigotlarla 1 saat ve metasiklik promastigotlarla 3 saat 34 oC'de inkübe edin.
not: Optimal enfeksiyon sıcaklığı türlere göre değişebilir.
- İnkübasyondan sonra, her bir kuyucuktaki serbest parazitleri 3x 2 mL PBS ile iyice yıkayın -/- önceden 37 °C.
'ye ısıtılmış
not: Lamellerin birbiri üzerinde yüzmemesini sağlamak için PBS'yi nazikçe dağıtın. Plakayı yavaşça döndürün ve ardından sıvıyı aspire edin. Çapraz kontaminasyonu önlemek için birden fazla parazit türü kullanıyorsanız ayrı aspirasyon uçları kullanın.
- Her bir kuyucuğu PBS'de -/- 1.5 - 2 mL% 2 PFA ile 10 dakika inkübe ederek 1 saat veya 3 saat zaman noktası örneklerini sabitleyin. 3x'i PBS -/- ile yıkayın. Son yıkamayı aspire etmeyin ve lamel içeren lamelleri PBS'de lekelenene kadar soğutmayın.
- Daha fazla zaman noktası için plakalardaki her bir oyuğa 2 mL taze BMM ortamı ekleyin ve 34 ° C'de inkübe edin.
- Kalan zaman noktalarını adım 4.3'te açıklandığı gibi istediğiniz gibi sabitleyin ve plakaları lekelenene kadar soğutun.
4. DAPI Boyama ve Lamel Montajı
- Lamel içeren kuyucuklardan PBS'yi aspire edin ve% 0,1 iyonik olmayan deterjan ile 1,5 mL PBS -/- ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin, ardından 2 mL PBS -/- ile 3 kez yıkayın.
- Lamel içeren kuyucuklara 2 μg / mL 4 ",6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (su içinde 5 mg / mL stok çözeltisinden seyreltilmiş) ile 1 mL PBS -/- ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat daha inkübe edin.
not: DAPI ile inkübasyon süresi, hücre içi Leishmania parazitlerinin uygun şekilde görselleştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Makrofaj çekirdekleri, daha büyük boyutları ve DNA içerikleri nedeniyle hızla boyanır, ancak hücre içi parazitlerin çekirdeklerinin boyanması daha yavaştır. Bu nedenle, inkübasyon süresinin BMM çekirdeklerini görselleştirmek için gerekenin ötesine uzatılması, DAPI'nin parazit plazma zarına ve parazit nükleer zarına nüfuz etmesine izin vermek için gereklidir. Uygun DAPI boyası ile, nükleer DNA'ya ek olarak, parazitin kamçı cebine yakın mitokondriyal kinetoplast DNA'sı da görselleştirilebilir.
- 2 mL PBS -/- ile 3x lamelleri içeren her bir kuyucuğu yıkayın ve ardından hücre tarafını aşağı yerleştirmek için lamelleri forseps ile kaldırın ve çevirin ve piyasada bulunan bir antifade montaj reaktifi ile cam mikroskop slaytlarına monte edin.
not: Lameller son derece kırılgandır ve dikkatli kullanım gerektirir. Kaldırırken, özellikle kuyuların yan duvarına karşı üzerlerine baskı uygulamaktan kaçının. Birkaç damla PBS eklemek -/- lamel ile kuyu arasındaki yüzey gerilimini azaltır ve kaldırma işlemini kolaylaştırır. Lamelleri kuyunun dibinden kaldırmaya yardımcı olmak için ince bir iğne kullanılabilir. Kızağa bir lamel yerleştirdikten sonra, montaj ortamındaki hava kabarcıklarını dışarı itmek için forseps ile hafifçe bastırın. Kaldırma işlemi sırasında bir lamel kırılmışsa veya muhtemelen ters dönmüşse, yeniden monte etmeyin; Sadece yedek dördüncü lamel kullanın.
- Slaytları nicelleştirmeye kadar soğutun.
5. Enfeksiyon Ölçümü
- Daldırma yağı (358 nm'de uyarma; 461 nm'de optimum emisyon) içeren 100X objektif lens kullanarak makrofajlara odaklanarak DAPI lekeli slaytları floresan mikroskobu altında inceleyin.
Odağın cam slayt ve lamel arasındaki makrofaj tabakası üzerinde olduğundan emin olun.
- Her bir görüş alanı için makrofajların sayısını (DAPI ile boyanmış büyük çekirdekler) ve her bir makrofaj çekirdeğinin etrafında kümelenmiş daha küçük amastigot çekirdeklerinin sayısını (bkz. Şekil 1A, DAPI) manuel bir sayaç kullanarak ölçün.
not: Amastigot çekirdeklerinin tümü, küçük boyutları nedeniyle tek bir odak düzleminde görünmeyebilir. Makrofaj çekirdeklerine odaklanıldığında görünür olanları sayın ve ardından makrofaj çekirdeklerinin üstündeki ve altındaki düzlemlerde parazit çekirdeklerini kontrol etmek için ince odak kullanın.
- Nicelemeyi tekrarlamak için başka bir görüş alanına geçin. Sayılan alan sayısını izlemek için ayrı bir sayaç tuşu kullanın. Sayım çakışmasını önlemek için her bir lamel boyunca paralel sıralar halinde görsel alanlar arasında hareket edin.
- Lamel başına en az 200 makrofaj miktarını belirleyin. Enfeksiyonun her bir zaman noktasını üç nüsha halinde ölçün (3 lamel kağıdı). Lamel üst üste binmesi, kötü montaj, cam kırılması vb. nedeniyle öncekilerden biri saymaya uygun değilse dördüncü lameli sayın.
not: Herhangi bir lamel üzerinde 200 makrofaj sayılamıyorsa, yedek dördüncüyü sayın.
- Enfeksiyon oranlarını amastigotlar/makrofaj veya amastigotlar/100 makrofajlar olarak hesaplayın ve ham kantitasyon verilerinden enfekte makrofajların yüzdesini belirleyin.
