Makrofajlarda Parazitin Hücre İçi Büyümesini Ölçmek için Bir İn Vitro Test

Özet

Kaynak: Sarkar, A., et al. Makrofajlar İçindeki Hücre İçi Büyümenin Ölçülmesi, Leishmania Parazitlerinin Virülansını Değerlendirmek İçin Hızlı ve Güvenilir Bir Yöntemdir. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, kemik iliği kaynaklı makrofajlardaki (BMM'ler) parazitlerin hücre içi büyümesini ölçmek için bir testi göstermektedir. Makrofaj hücreleri, sırasıyla Leishmania'nın motil ve non-motil invaziv evreleri, metasiklik promastigotlar ve amastigotlar ile enfekte olur. Parazitler makrofajları istila eder, parazitoforöz bir vakuol içinde içselleşir ve içinde çoğalır. Hücre içi parazit büyümesi, makrofaj ve parazit çekirdeklerinin floresan olarak boyanması üzerine bir mikroskop kullanılarak ölçülür.

Protokol

>1. BMM'lerin Enfeksiyon için Lameller Üzerine Kaplanması

1. Her boş kuyucuğun dibine dört (4) adet steril 12 mm cam lamel (otoklavlanmış ve kapalı bir cam kapta saklanmış) yerleştirerek 6 oyuklu doku kültürü plakaları hazırlayın.
   not: Her bir steril 12 mm'lik lamel içini, bir vakum hattına takılan bir aspirasyon ucu ile alın. Lamelleri üst üste binmeden kuyucuklara yerleştirin ve vakumu kesmek için boruyu sıkıştırarak istenen konumda serbest bırakın.
2. Yapışık kemik iliği türevi makrofajlarla kaplanmış Petri kaplarından aspire ortamını (ve yapışık olmayan hücreleri) aspire edin ve yapışık hücreleri 2x, önceden....

Sonuçlar

Şekil 1: L. amazonensis'in virülan aksenik amastigotları (A) ve virülan olmayan log faz promastigotları (B) ile BMM enfeksiyonunun temsili bir gösterimi. Enfeksiyondan 1 saat ve 48 saat sonra BALB / c farelerinden izole edilen makrofajların immünofloresan görüntüleri. Enfekte makrofajlar, protokolde tarif edildiği gibi immünofloresan için işlendi. PV membranları, 1 saat boyunca sıçan.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
6 kuyulu hücre kültürü plakası	Hücre Yıldızı	657160
Adenin	Acros Organik	AC147440250
Aerosol Bariyer Pipet Uçları (100-1000 μL)	Balıkçı markası	02-707-404
Aerosol Bariyer Pipet Uçları (20-200 μL)	Balıkçı markası	02-707-430
Aerosol Bariyer Pipet Uçları (2-20 μL)	Balıkçı markası	02-707-432
Bard-Parker Kaburga Sırtlı Karbon Çelik Cerrahi Bıçak #10	Aspen Cerrahi	371110
BD Luer-Lok Tip 10 mL Şırınga	Becton Dickinson (BD)	309604
BD Precisionglide İğne, 25G	Becton Dickinson (BD)	305124
Hücre Kültürü Kabı 35 mm x 10 mm	Hücre Yıldızı	627 160
Hücre Kültürü Şişesi	Hücre Yıldızı	660175
Kapak Camları: 12 mm daireler	Balıkçı markası	12-545-80
DAPI (4',6-Diamidino-2-fenilindol, dihidroklorür)	Canlandırıcı	D1306
D-Biyotin	J.T. Fırıncı	C272-00
Edta	Sigma Aldrich	Eds
Etil alkol 200 kanıt	Pharmco-AAPER	111000200
Falcon 100 mm x 15 mm TC ile işlem görmemiş polistiren Petri kabı	Corning	351029
Fetal Sığır Serumu	Seradigm Belediyesi	1500-500
Ficoll400	Sigma Aldrich	F8016
Floresan Mikroskobu	Nikon	E200
Keçi anti-fare IgG Teksas kırmızı	Canlandırıcı	T-862
Keçi anti-tavşan IgG AlexaFluor488	Canlandırıcı	A-11034
Hemin	Tokyo Kimya Sanayi A.Ş. LTD	H0008
HEPES (1M)	Gibco (Gibco)	15630-080
İzoton II Seyreltici	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	8546719
L-Glutamin	Gemini	400-106
Orta 199 (10X)	Gibco (Gibco)	11825-015
Na piruvat (100 mM)	Gibco (Gibco)	11360-070
Paraformaldehit	Alfa Aesar	43368
Penisilin / Streptomisin	Gemini	400-109
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (-/-)	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	14200166
Polipropilen konik Santrifüj Tüpleri 15 mL	Hücre Yıldızı	188 271
Polipropilen konik Santrifüj Tüpleri 50 mL	Hücre Yıldızı	227 261
ProLong Gold antifade reaktifi	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	P36930 Serisi
Sıçan anti-fare Lambası-1 antikoru	Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası	1D4B
Rekombinant İnsan M-CSF	PeproTech Teknolojisi	300-25
Reichert Parlak Çizgi Hemositometre	Hausser Bilimsel	1492
RPMI Orta 1640 (1X)	Gibco (Gibco)	11875-093
Triton X-100 Yüzey Aktif Madde	Kırlangıç Sigma	TX1568-1
Tripan Mavisi	Sigma Aldrich	T8154
Hassas Makas, 4 1/2"	VWR (VWR)	82027-582
Diseksiyon forsepsleri, ince uç	VWR (VWR)	82027-386
Mikroskop Slaytları	VWR (VWR)	16004-368
Z1 Coulter Partikül Sayacı, Çift Eşik	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	6605699

Serisi Serisi · arası Serisi · Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi arası arası arası Serisi · Serisi