$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Bakterilerin Hazırlanması
>NOT: Tam hücreli bakteri substratları ve saflaştırılmış peptidoglikanlar, hem mikroslayt difüzyon testinde hem de boya salım testinde enzim substratları olarak kullanılır. Bu substratlar, enzim reaksiyonlarını gerçekleştirmeden önce hazırlık gerektirir. Aşağıdaki protokol bunların hazırlanmasını açıklamaktadır.
- Tüm Bakteri Hücresi Substratı
- 500 ml besin suyunu gece boyunca 2 ml Bacillus subtilis 168 kültürü ile aşılayarak bakteri hücresi substratı üretin (Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu; ATCC 23857). Kültür, bakteri kültürünün iki katına çıkmasıyla sonuçlanan hızlı bir büyüme aşaması olarak tanımlanan üstel bir büyüme aşamasına ulaşana kadar çalkalayarak (125 rpm) 30 ° C'de inkübe edin. Salmonella enterica subsp. enterica (ATCC 10708), 37 ° C'de çalkalama (125 rpm) ile büyüme ortamı olarak besin suyu kullanın.
- 3 atm basınç altında 121 ° C'de 10 dakika boyunca otoklavlayarak her kültürü ısıyla öldürün.
- Isıyla öldürülen bakteri substratını 5.000 x g'da 20 dakika santrifüjleme ile hasat edin. Peleti Tip 1 su ile üç kez yıkayın ve minimum miktarda su ile tekrar süspanse edin. Bu çalışmada, substratları 1.200 μl'de süspanse edin.
- Bakteri hücresi substratlarının 300 μl'sini 1.5 ml'lik mikrofüj tüplerine alın ve 20 °C'de saklayın.
>2. Yüzey Etiketleme - Remazol Brilliant Blue R Boya Etiketleme
NOT: Boya salım testinde, substrat Remazol parlak mavi R boyasına kovalent olarak bağlanır. Aşağıdaki protokol, boyanmış enzim substratlarının hazırlanmasını açıklar.
- 200 mM Remazol parlak mavi R boya (RBB) çözeltisi yapmak için kullanılacak 99 ml Tip I su içinde 1 g NaOH'yi çözerek 250 mM'lik bir sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisi yapın.
- 1.25 g RBB'yi 98.75 ml ± 1 ml taze 250 mM NaOH çözeltisi içinde çözerek 200 mM'lik bir RBB çözeltisi yapın.
- Isıyla öldürülen bakteri hücrelerini, 30 ml RBB çözeltisi içinde 0.5 g ıslak ağırlık konsantrasyonunda yeniden askıya alın. Saflaştırılmış peptidoglikan için, peptidoglikanı 30 ml RBB çözeltisi içinde 0.3 g ıslak ağırlık konsantrasyonunda yeniden süspanse edin.
- Reaksiyon karışımını bir Erlenmeyer şişesinde dönen bir platform üzerinde 37 ° C'de 6 saat boyunca hafifçe karıştırarak inkübe edin.
- Reaksiyon karışımını 4 °C'lik bir inkübatöre aktarın ve hafifçe karıştırarak 12 saat daha inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, boyalı substratı 30 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleme ile hasat edin. Boya çözeltisini substrat peletinden boşaltın.
- Boya etiketli hücreleri veya peptidoglikanı Tip I su ile tekrar tekrar (yaklaşık 3-5 yıkama) yıkayarak ve ardından santrifüjleyerek kovalent bağlı olmayan çözünür boyayı substratlardan çıkarın. Her su ilavesinde, peleti iyice yeniden askıya alın.
not: Bağlanmadığında, santrifüjlemeden sonra su yıkamasında çözünür boya artık görünmez. Alt tabakaya bir ek yıkama yapılmalıdır. Alt tabakanın mavi kalacağını, son yıkamanın süpernatantının ise berrak olacağını unutmayın.
- Boyalı alt tabakaları daha sonra kullanmak üzere -20 °C'de minimum miktarda suda asılı olarak saklayın.
3. Kantitatif Boya Salınımlı Test
>NOT: Boya salım tahlili sırasında, enzimatik reaksiyonda RBB ile boyanmış substratın hidrolizi, boyalı ürünleri reaksiyon süpernatantına bırakır. Salınan boya miktarının kolorimetrik ölçümü, belirli bir enzim için numune içinde bulunan enzimatik aktivite miktarını gösterir. Kantitatif yöntem, substratlar arasında farklı enzimlerin karşılaştırılmasına izin verir ve enzimatik reaksiyonu etkileyen çevresel koşulların (örneğin, sıcaklık, tuzluluk ve pH) değişmesine izin verir. Aşağıdaki protokol, protein antimikrobiyallerinin enzimatik aktivitesini kantitatif olarak tespit etmek için boya salım testinin hazırlanmasını ve performansını açıklamaktadır.
- Boya Salınım Testi için Hazırlık
- Donmuş boyalı substratın oda sıcaklığına dönmesine izin verin ve verilen enzim için ampirik olarak belirlenen tahlil tamponu (fosfat tamponlu salin, PBS) ile iki kez yıkayın.
- 200 μl reaksiyon hacmini gerçekleştirilecek boya salım testlerinin sayısı ile çarparak ihtiyaç duyulan substrat süspansiyonu hacmini hesaplayın.
- Bir spektrofotometre kullanılarak 595 nm'de 2.0'lık bir optik yoğunluk (OD) elde edilene kadar, 4.1.2'de belirlenen tahlil tamponunun hacmine boyalı substrat ekleyerek substrat süspansiyonunu hazırlayın. Spektrofotometrenin işlevsel sınırlamaları içinde kalmak için, konsantre çözeltinin 1:1 seyreltilmesi için 2.0 OD595'i 1.0 olarak ölçün. Tahlil tamponunu boş olarak kullanın.
not: Reaksiyon için substrat bulanıklığı, yüksek verimli enzimlerin aktivite seviyelerine uyacak şekilde 2.0'ın üzerine çıkarılabilir.
- Değerlendirilecek protein antimikrobiyalini tahmini 1 mg / ml konsantrasyonda tahlil tamponunda askıya alın.
- Üreticinin protokolüne göre bir Biskintoninik asit (BCA) Protein Test Kitinin mikroplaka testini kullanarak, test edilecek protein numunesinin gerçek konsantrasyonunu belirleyin. Test tamponu kullanarak stok süspansiyonunun konsantrasyonunu 1 mg / ml'ye ayarlayın.
- Bir protein antimikrobiyal için en uygun inkübasyon koşullarını belirlemek için boya salım testinin kullanılması
- Stok protein antimikrobiyal süspansiyonunu 100 ng / μl'ye seyreltin. Bu konsantrasyon, tahlil reaksiyonuna eklenen hacim başına 1 μg proteinin (10 μl) nihai reaksiyon kütlesini verir.
- Bakteriyolitik protein için değerlendirilecek termal aralığı belirleyin. Bu deneylerdeki termal aralık 5 °C, 15 °C, 25 °C, 35 °C, 45 °C, 55 °C ve 65 °C'dir.
- Reaksiyon testlerini 0.5 ml'lik mikrofüj tüplerinde gerçekleştirin. Her termal koşul için, 200 μl hazırlanmış substrat süspansiyonuna 10 μl stok protein ekleyin.
- Saatte bir kez ters çevirerek karıştırarak 8 saat boyunca bir termal döngüleyicide inkübe edin.
- İnkübasyonun ardından, 25 μl etanol ekleyerek reaksiyonları durdurun.
- Sindirilmemiş, çözünmeyen substratı 2 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleme ile çıkarın ve her reaksiyon karışımı için 150 μl reaksiyon süpernatanı 96 oyuklu düz tabanlı bir mikroplakaya aktarın, sindirilmemiş substrat peletini bozmamaya dikkat edin.
- Enzimatik hidrolizden sonra substrattan ayrılan çözünür RBB boyasının miktarını belirleyerek verilen substrat için protein antimikrobiyalinin enzimatik aktivitesini ölçün. Enzimatik aktiviteyi ölçmek için, bir mikroplaka spektrofotometresi kullanarak süpernatantın absorpsiyonunu 595 nm'de ölçün. Etiketli substrattan süpernatan salınan çözünür boya tarafından artan absorbans, enzimatik aktivitenin kantitatif bir ölçümüdür.
not: Absorpsiyondaki değişiklik, 1 AU'nun 595 nm'de boya salma reaksiyonu süpernatantının optik yoğunluğunda 0.01'lik bir artışa neden olduğu aktivite birimleri (AU) ile temsil edilir. Enzim dışındaki tüm reaksiyon bileşenleri ile inkübe edilen boş bir reaksiyon, inkübasyon nedeniyle RBB etiketli substrattan salınan herhangi bir boyayı çıkarmak için kullanılır. Optimum enzimatik sıcaklık, en yüksek aktivite birimi ölçümünü sağlar.