1. Kültür Ortamı, Antibiyotikler ve 2-[2-nitro-4- (triflorometil)benzoil]-1,3-sikloheksandion (NTBC)
hazırlanması
- Luria-Bertani (LB) suyu (%1 tripton, %0.5 maya özütü, %0.25 sodyum klorür, H2O'da NaCl) yapın ve uygun hacimlere alikot yapın. Otoklav ile sterilize edin. Oda sıcaklığında saklayın.
- 250 ml'lik şişelerde 100 ml LB agar (%1 tripton, %0.5 maya özütü, %0.25 NaCl, H2O'da %1.5 agar) yapın. Otoklav ile sterilize edin ve oda sıcaklığında saklayın. Plakalara dökmeden önce agarın eridiğinden emin olun.
not: 100 ml LB agar içeren şişeler 4 plaka verecektir. LB agar miktarı, tahlil için gereken plaka sayısına karşılık gelecek şekilde değiştirilebilir.
- Fosfat tamponlu tuzlu su, PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM potasyum klorür, KCl, 10 mM Disodyum hidrojen fosfat,Na2HPO4, 2 mM potasyum dihidrojen fosfat, KH2PO4) yapın. Otoklav veya filtrasyon ile sterilize edin ve oda sıcaklığında saklayın.
- Gentamisin, kanamisin ve tobramisin için antibiyotik stok solüsyonlarını hazırlayın.
- 100 mg / ml gentamisin, 30 mg / ml kanamisin ve 10 mg / ml tobramisin içeren Pseudomonas aeruginosa suşları için uygun antibiyotik stok konsantrasyonları hazırlayın. Antibiyotikleri suda çözün, süzerek sterilize edin (0.2 μm) ve 4 ° C'de saklayın. İncelenen bakteriye bağlı olarak antibiyotikleri ve konsantrasyonları değiştirin.
2. Oksidatif Stres Yanıtı için Spot Plaka Testi
- Test edilecek suşların gece boyunca kültürlerini ayarlayın. 16 x 150 mm'lik test tüplerine (suş başına bir tane) 2 ml LB suyu ekleyin ve her suştan 1 izole koloni ile aşılayın. Bir hava inkübatöründe bir doku kültürü döndürücüsü üzerinde havalandırma ile 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
- Gece boyunca alınan kültürlerin OD600'ünü ölçün. Ortamda bulunan pyomelanini ortadan kaldırmak için OD600 okumalarını almadan önce kültürleri yıkayın.
- Kültürleri, 1 ml kültürü 16.000 x g'da bir mikrosantrifüjde 2 dakika santrifüjleyerek yıkayın. Süpernatanı ve gevşek peletlenmiş hücreleri bir mikro pipetleyici ile çıkarın ve katı hücre peletini 1 ml LB içinde yeniden süspanse edin.
- Ertesi gün, oksidatif stres etkeni olarak H2O2 içeren LB agar plakalarını hazırlayın. 0 ila 1 mM arasında birH2O2 konsantrasyonları aralığı iyi bir başlangıç noktasıdır.
- LB agar şişelerini eritin. Ortamı oda sıcaklığında yaklaşık 50 °C'ye soğutun.
- H2O2'yi doğrudan soğutulmuş ortama istenen konsantrasyonlarda ekleyin. Karıştırmak için girdap şişeleri kullanın. Eklenecek H 2 O2 konsantrasyonları ve konsantre H2O2 hacimleri için Tablo 1'e bakınız. Bu değerler 100 ml LB agar'a dayanmaktadır.
- H2,O2 eklediktenhemen sonra plakaları dökün ve kabarcıkları çıkarmak için yüzeyi alevlendirin. Verim, 100 ml LB agar başına 4 plakadır. Plakaları H2O2 konsantrasyonu ile işaretleyin.
- Plakalardaki fazla nemi gidermek için plakaları, fan 30 dakika çalışacak şekilde biyolojik bir akış başlığına üstü açık olarak yerleştirin.
not: Tabakları hazırlandıkları gün kullanın. Bunun yapılmaması, tutarsız verilere neden olabilir.
not: Paraquat gibi oksidatif stresörler bu testteH2O2ile ikame edilebilir. Diğer oksidatif stresörler için kullanılan konsantrasyonlarH2O2için kullanılanlardan farklı olabilir.
- Gece boyunca yapılan kültürlerin OD600'ünü yıkayın ve ölçün.
- Tüm gece kültürlerinin OD600'ünü, test edilen suş seti için en düşük değere normalleştirin. P. aeruginosa, LB'de gece boyunca büyütüldüğünde genellikle yaklaşık 2.5'lik bir OD600'e sahiptir.
- Kültürü toplam 1 ml'lik bir hacimde en düşük OD600'e seyreltmek için gereken kültür hacmini belirleyin. Örneğin, bir kültürün OD600'ü 3 ise ve suş seti için en düşük OD600 2.5 ise, aşağıdaki hesaplamayı yapın: (2.5)(1 ml) = (3)(x). x = 0.833 ml. 0.833 ml kültür bir mikrofüj tüpüne yerleştirilecektir.
- Kültür hacmini 1 ml'ye getirmek için gereken LB + DMSO miktarını hesaplayın. Adım 4.4.1'deki örnek için, kültüre eklenen LB + DMSO miktarı 0.167 ml olacaktır (1 ml toplam hacim – 0.833 ml kültür). Tüm suşları seyreltmek için gereken hacme bağlı olarak bu seyreltmeler için kullanmak üzere LB + DMSO'nun stok çözeltilerini yapın.
- Kültürü ve LB + DMSO'yu girdaplama ile karıştırın.
- Kültürleri sabit bir DMSO konsantrasyonunda tutmak için, PBS + DMSO'da normalleştirilmiş gece kültürlerinin on kat seri seyreltmelerini gerçekleştirin.
- PBS + DMSO'nun stok çözümünü yapın. Bir suş için bir seyreltme seti için, toplam 720 μl'lik bir hacim elde etmek için 300 μM hacim DMSO'yu PBS ile karıştırın. Kaç suşun test edildiğine bağlı olarak bu stokları yukarı veya aşağı ölçeklendirin.
- Mikrofüj tüplerini 10-1 ila 10-7 seri seyreltme için etiketleyin. Uygun tüplere 90 μl PBS + DMSO ekleyin. LB + DMSO'da yetiştirilen suşlar için PBS + DMSO kullanın.
- Uygun 10-1 seyreltme tüpüne 10 μl kültür ekleyin. Girdaplama ile karıştırın ve 10-1 seyreltmenin 10 μl'sini 10-2 seyreltme tüpüne aktarın. Tüm seyreltmeler yapılana kadar tekrarlayın. Seyreltmeler arasında pipet uçlarını değiştirin.
Her - suş için LB + H2O2 plakaları üzerinde 10-3 ila 10-7 seyreltmenin 5 μl'sini çift olarak işaretleyin. Noktalar en seyreltik ila en az seyreltik (10-7 ila 10-3) kaplanmışsa bir pipet ucu kullanın. Sıvı plakaya kuruyana kadar plakayı eğmeyin veya eğmeyin.
- Suşa bağlı olarak plakaları 37 ° C'de (hava inkübatör) 24-48 saat inkübe edin.
NOT: P. aeruginosa PAO1, 24 saatlik inkübasyondan sonra LB üzerinde iyi büyüklükte kolonilere sahip olacaktır. Suşları, PAO1 ile yaklaşık olarak aynı büyüklükte kolonilere sahip olana kadar inkübe edin.
- Bir translüminatörün üzerinde bir CCD kamera kullanarak plakaların fotoğrafını çekin. İsteğe bağlı olarak, fotoğrafları kontrast için düzenleyin ve aynı boyuta kırpın. Oksidatif strese duyarlılıktaki değişiklikleri belirlemek için her noktadaki koloni sayısını sayın.
Tablo 1: Oksidatif stres spot plaka testi için LB agar'a eklenecek H2O2 konsantrasyonları. Bu tablo, 100 ml LB agar'a eklemek için çeşitli H2O2 konsantrasyonlarını ve karşılık gelen konsantre H2O2 stok miktarını verir.
| H2O2'nin nihai konsantrasyonu (mM) | Miktarı 9.79 M H2O2 (ağırlıkça% 30) eklenecek (μl) |
| 0 | 0 |
| 0,2 | 2,04 |
| 0,4 | 4,09 |
| 0,6 | 6,13 |
| 0,8 | 8,17 |
| 1 | 10.21 |
