$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Bakteri Türü ve Büyüme Ortamı
- 25 g sığır serum albümini, 10.0 g dekstroz ve 4.05 g sodyum klorürü 460 mL deiyonize suda çözündürerek albümin dekstroz ve tuz stok çözeltisi (ADS) yapın. ADS'yi filtreyle sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.
- 9 mL arıtılmış suya 4.7 g 7H9 tozu ve 2 mL gliserol ekleyerek 900H9 suyu yapın. 7H9 suyunu 121 °C'de 10 dakika otoklavlayın ve devam etmeden önce oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. 100 mL ADS ve 0.5 mL Tween80 ila 900 mL 7H9 et suyu ekleyerek 7H9ADST yapın. 4 °C'de saklayın.
- 50 mg kanamisin sülfatı tartın ve 1 mL deiyonize su içinde çözün; nihai konsantrasyon 50 mg / mL'dir. Filtreyle sterilize edin ve -20 °C'de saklayın. 1 L 7H9ADST.
başına 0,5 mL kanamisin stok çözeltisi ekleyin
not: Bu ortam taze yapılmalıdır, bu nedenle hacimleri kültür boyutuna göre uygun şekilde ölçeklendirin.
- Ayakta kültürde kanamisin ile desteklenmiş 7H9ADST'de M. tuberculosis'i büyütün. Kültürü günlük olarak çalkalayın ve topaklanmayı önlemek için OD600 1.0'a ulaşmadan önce seyreltin.
not: Bu yöntemin geliştirilmesi için kullanılan M. tuberculosis suşu, pJAK2.A plazmidi ile dönüştürülmüş H37Rv idi. pJAK2.A, hsp60 promotöründen ateşböceği lusiferaz geninin yüksek seviyeli ekspresyonuna izin veren ve kanamisin kullanılarak seçilebilen pMV361 vektörüne dayanan bütünleştirici bir plazmittir.
2. Resazurin Testi Kullanılarak Et Suyu İçi Aktivite Analizi
- M. tuberculosis'i 7H9ADST'de orta log fazına (~ 0.5 - 0.8 OD600) kadar büyütün. Kültürü 7H9ADST ile 0.01 OD600'e seyreltin. Bileşikleri 7H9ADST'de test konsantrasyonlarının 2 katına kadar seyreltin ve her bir seyreltilmiş bileşiğin 100 μL'sini her bir oyuğa alikot edin.
- Her bir oyuğa 100 μL seyreltilmiş bakteri süspansiyonu aktarın. Plakaların nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de 5 gün inkübe etmesine izin verin. 10 mg resazurini 100 mL deiyonize su ve steril bir filtrede çözün.
- 30 μL resazurin çözeltisi ekleyin ve 48 saat sonra renk değişimini izleyin; bakteri üremesi maviden pembeye bir renk dönüşümü ile gösterilir.
not: Kantitatif bir analiz, 530 - 560 nm'de uyarma ile 590 nm'de floresan veya 570 nm ve 600 nm'de absorbans ölçülerek de gerçekleştirilebilir.