PBMC'lerle Birlikte Kültürlenmiş X-Işını ile Işınlanmış Epitel Hücrelerinde TEER'in Ölçülmesi

Özet

Kaynak: Babini, G., et al. X-ışını Işınlanmış Caco-2 Hücreleri ve PBMC Arasındaki Karışmayı Araştırmak İçin Bir Ko-kültür Yöntemi. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, PBMC hücrelerinin hem varlığında hem de yokluğunda ışınlanmış Caco-2 hücrelerinde trans-epitelyal elektrik direncinin ölçümünü göstermektedir. Bu yöntem, radyasyon ve bağışıklık hücrelerinin epitel hücre bariyeri üzerindeki sinerjik etkilerinin incelenmesini sağlar.

Protokol

1. Işınlama Kurulumu

Not: Caco-2 hücrelerinin ışınlanması, Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) S. Maugeri'nin (Pavia, İtalya) radyoterapi bölümünde, farklı kanser türlerini tedavi etmek için rutin olarak kullanılan doğrusal bir hızlandırıcı ile gerçekleştirildi.

1. Foton X-ışını enerjisini 6 MV tepe noktasına ayarlayın. Doğrusal hızlandırıcı bir darbe rejiminde çalışır (iki ardışık darbe arasındaki süre yaklaşık 4 ms; tek bir darbenin süresi yaklaşık 5 μs ve doz hızı 1 × ^10-3 Gy/p).
2. Caco-2 ile ekler içeren 6 oyuklu plakaları, radyasyon kaynağından 100 cm uzakta 1,4 cm kalınlığında bir Pleksiglas levha (kullanılan radyasyonun birikmesinden biraz daha büyük bir mesafeye karşılık gelir) üzerine X-ışınlarının yörüngesine yerleştirin.
3. Geri saçılan radyasyon bileşenini ve yüklü parçacıkların dengesini garanti etmek için ışınlama gerçekleşmeden önce her numuneye 0,5 cm kalınlığında bir bolus yerleştirin.
4. Hücreleri (2 - 10 Gy aralığındaki dozlar) düz ve simetrik (% ± 20 cm) 20 x 20_cm2 radyasyon alanı ve 3 Gy / dak.
   doz oranı ile ışınlayın not: Kontrol "sahte" ışınlanmış hücreler, ışınlama odasına girmeden ışınlanmış olanlarla aynı prosedürel koşullara maruz kaldı (alınan doz: 0 Gy).
   Dikkat: İyonlaştırıcı radyasyon üreten cihazlar sadece uzman personel tarafından kullanılmalıdır.

2. Trans-Epitelyal Elektrik Direnci (TEER)

1. Işınlamadan bir hafta önce 5 × 10⁵ Caco-2 hücresini 6 oyuklu plaka ko-kültür eklerinde (polietilen tereftalat (PET), 2 x 10⁶ gözenek/cm2) tohumlayın.
2. Işınlamadan 1 saat önce TEER'i bir voltmetre/ohmmetre ile ölçün.
3. Hücreleri adım 1.1 - 1.4'te açıklandığı gibi ışınlayın.
4. Caco-2 hücrelerini, %5 CO 2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de PBMC ile ko-kültür varlığında/yokluğunda inkübe edin.
5. Işınlamadan sonraki ilk birkaç saat boyunca, TEER'i her saat başı ve ardından her 3 saatte bir 48 saate kadar ölçün.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Çok kuyulu plakalar için ThinCert 6 kuyulu hücre kültürü ekleri	Greiner Biyo-bir	657610	ekipman
Hücre Kültürü Çok Kuyulu Plaka, 6 Kuyulu	Greiner Biyo-bir	657160	plastik
Hücre Kültürü Çok Kuyulu Plaka, 24 Kuyulu	Greiner Biyo-bir	662160	plastik
L-Glutamin içermeyen RPMI 1640	Fransa	12-167F	Reaktif
Millicell-ERS voltmetre/ohmetre	Kırlangıç	MERS 00001	ekipman