Antibakteriyel Ajanların Talınması için Bir Peg Plaka Biyofilm Testi

Özet

Kaynak: Dalecki, AG, et al. Resazurin Bazlı İlaç Duyarlılık Testi Kullanılarak Biyofilm İlişkili Staphylococcus aureus'un Hedeflenmesi. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu videoda, bir peg plakası kullanarak biyofilmleri etkili bir şekilde ortadan kaldıran antimikrobiyal bileşiklerin taranması için bir test gösterilmektedir. Metodoloji, antimikrobiyal bileşiklerle muamele edildikten sonra biyofilmin metabolik durumunu izleyerek minimum biyofilm eradikasyon konsantrasyonunun belirlenmesini kolaylaştırır.

Protokol

1. Biyofilm Başlatma

1. Besin açısından zengin bir ortamda biyofilm üreten organizmalardan oluşan bir kültür oluşturun. Staphylococcus aureus suşu Newman'ı bir gliserol stoğundan 10 ml Mueller-Hinton ortamında aşılayın. S. aureus'un eldivenle ve bir biyogüvenlik kabini içinde kullanılmasıyla ilgili tüm işleri gerçekleştirin.
2. Döner bir çalkalayıcı (100-200 rpm) üzerinde 37 °C'de 16 saat inkübe edin.
3. Bir spektrofotometre ve standart bir küvet (yol uzunluğu: 1 cm) kullanarak kültürün OD_600'ünü belirleyin.
4. Aşağıdaki formülü kullanarak şelatlı Roswell Park Memorial Institute ortamında (CRPMI) 0.1 OD_{600 (aşı)} ile 20 ml aşı hazırlamak için gereken kültür hacmini (V) hesaplayın: [V = 20 ml * 0.1 / OD_{600 (kültür)}].
   1. Hesaplanan kültür hacmini (yukarıdan) bir santrifüj tüpüne ve 10.000 x g'da 1 dakika döndürerek pelet hücrelerine ekleyin. Biyofilm aşısını hazırlamak için, harcanan büyüme ortamını aspire edin ve hücre peletini 20 ml CRPMI'de yeniden süspanse edin.
5. Aşıyı 25 ml'lik bir hazneye dökün.
6. Kapağı düz bir şekilde yukarı çekerek steril bir 96 oyuklu dübel plakasından dikkatlice çıkarın.
   Not: Kapaktan sarkan mandalların kirlenmemesine dikkat edilmelidir. Kapak, bir biyogüvenlik kabini içinde temiz bir yüzeye baş aşağı yerleştirilebilir.
7. 200 μl'lik çok kanallı bir pipet kullanarak, alt plakanın A'dan G'ye kadar olan sıralarının her birine 125 μl inokülum ekleyin.
8. Sterilite kontrolü olarak H sırasının her bir kuyucuğuna 125 μl steril CRPMI ortamı doldurun.
9. Mandal kapağını alın ve mandallar aşağı bakacak şekilde plaka tabanının üzerinde tutun. Tek tek mandalları ilgili kuyucuklarıyla dikkatlice hizalayın. Plaka ve mandallar arasında fiziksel temastan kaçının. Hizalandıktan sonra kapağı dikkatlice aşağı indirin. Mandallar alt plakaya temas ettikten sonra yapılan yeniden ayarlamalar, H sırasındaki sterilite kontrollerini kirletebileceğinden, yanlış hizalamalardan kaçının.
10. Buharlaşmayı önlemek için kapağı plakaya parafin film ile kapatın ve sıkıca kapatarak sızdırmaz bir plastik torbaya koyun. Buharlaşmayı en aza indirmek için torbadaki hava hacmini mümkün olduğunca düşük tutun.
11. %5 CO₂ inkübatörde 37 °C'de 48 saat çalkalamadan inkübe edin.
    Not: 48 saatlik büyüme S. aureus için en uygun olmuştur, ancak kullanılan organizmaya göre değişecektir.
    not: Statik inkübasyon, testi optimize etmek için iyi bir başlangıç noktası olsa da, bir mikroplaka çalkalayıcı üzerinde 150 rpm'de hafifçe çalkalamak, bazı S. aureus izolatlarının biyofilm oluşumunu artırabilecek olası bir varyasyondur.

2. Biyofilm Mücadele Plakasının Hazırlanması

1. Biyofilm yarışmasının yapıldığı gün, 96 oyuklu yeni bir plaka alın ve B'den H'ye kadar olan sıraların her bir oyuğuna RT'ye dengelendirilmiş 100 μl CRPMI ekleyin. Tutarsız sonuçlardan kaçınmak için, mandallar içerideyken 200 μl ortam tutabilen ve biyofilm başlatma plakasınınkiyle aynı boyutlara sahip oyuklara sahip 96 oyuklu bir plaka kullanın.
2. Adım 2.7.
   'de nihai bir seyreltmeyi hesaba katmak için, 4 adede kadar test bileşiğini 1.0 ml CRPMI içinde ayrı ayrı istenen nihai konsantrasyonun 2 katına kadar seyreltin Not: İyi bir başlangıç noktası, planktonik hücrelerin inhibitör konsantrasyonunun 8 kat üzerindedir.
3. A1 ila A3 kuyularına 200 μl bileşik 1, A4 ila A6 kuyularına bileşik 2, A7 ila A9 kuyularına bileşik 3 ve A10 ila A12 kuyularına bileşik 4 ekleyin.
4. Test bileşiklerini çok kanallı bir pipet kullanarak seri olarak seyreltin ve 100 μl'yi A satırından B satırına aktarın ve karıştırın.
5. Bu şekilde 100 μl'lik kuyuyu kuyuya aktarmaya devam edin. Her aktarımdan sonra karıştırın ve F sırasında durun.
6. Karıştırdıktan sonra, F sırasından 100 μl'yi bir atık kabına boşaltın. G ve H sıralarına herhangi bir sıvı aktarmayın.
7. Hacmi 200 μl'ye getirmek için çok kanallı bir pipet kullanarak plakanın her bir oyuğuna 100 μl CRPMI ekleyin. Son plaka düzeni için Şekil 1'e bakın.

3. Biyofilm Yarışması

1. Biyofilm başlatma plakasınınkiyle aynı boyutlara sahip oyuklara sahip taze steril 96 oyuklu bir plakaya 200 μl fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin.
2. Plastik torbayı ve parafin filmini inkübe edilmiş biyofilm başlatma plakasından çıkarın.
3. Kapağı düz bir şekilde yukarı kaldırın. Biyofilme zarar verebileceğinden mandallar ile plaka tabanı arasındaki temastan kaçının. Alt kısmı sonraki OD₆₀₀ analizi için saklayın (bkz. 3.8).
4. Peg kapağını PBS içeren plakaya yerleştirerek planktonik hücreleri durulayın (adım 3.1'den itibaren). Mandalları 5 saniye daldırın, PBS'den kaldırın ve mandalları kuyu kenarlarına çarpmamaya dikkat ederek bir kez daha daldırın.
5. Durulanmış mandal kapağını meydan okuma plakasına yerleştirin. Mandallar ve alt plaka arasında gereksiz temastan kaçının çünkü bu, biyofilme zarar vererek tutarsız sonuçlara yol açacaktır.
6. Plakayı parafin film ile kapatın ve adım 1.10'da açıklandığı gibi sızdırmaz bir plastik torbaya koyun.
7. Plakayı %5 CO₂ inkübatörde 37 ° C'de 24 saat çalkalamadan inkübe edin.
8. Biyofilm başlatma plakasının altını 3.3'ten alın. Çok kanallı bir pipet kullanarak her bir oyuktaki bakterileri yeniden süspanse edin ve H sırasındaki sterilite kontrolleri hariç tüm oyuklarda meydana gelen büyümeyi doğrulamak için OD_600'ü uygun bir mikroplaka okuyucu ile ölçün.

4. Biyofilm Tayini

1. Resazorin dönüşümünü tespit etmek için bir inkübasyon odası ile donatılmış ve kinetik floresan okumaları alabilen bir plaka okuyucu kullanın. 530 nm uyarma ve 590 nm emisyon kullanarak 24 saatlik kinetik floresan ölçümü ayarlayın.
2. Hazne sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın ve plakanın her 20 dakikada bir okunmasını sağlayın. Plaka okuyucuyu, üreticinin talimatlarına göre plakanın altından ölçecek şekilde ayarlayın.
3. Steril 96 oyuklu bir plakaya çok kanallı bir pipetle 200 μl PBS ekleyerek yıkama plakasını hazırlayın.
4. 16 μg / ml resazurin.< / br / > nihai konsantrasyonuna 20 ml CRPMI ortamına 400 μl 0.8 mg / ml resazurin stok çözeltisi ekleyerek biyofilm geri kazanım ortamı hazırlayın not: Resazurin bilinen bir cilt tahriş edicidir. Kullanım sırasında laboratuvar önlüğü, su sıçratan gözlük ve eldiven kullanın. Biyofilm geri kazanım ortamı olarak CRUMI, en düşük arka plan sinyalini sağladığı için kullanılmıştır, ancak uygunsa Mueller Hinton ortamı ile değiştirilebilir.
5. 96 oyuklu yeni bir plakanın her bir oyuğuna çok kanallı bir pipet ile 150 μl biyofilm geri kazanım ortamı ekleyin.
6. Sorgulama plakasını inkübatörden bir biyogüvenlik kabinine aktarın ve plastik torbayı ve sızdırmazlık filmini dikkatlice çıkarın.
7. Peg kapağını meydan okuma plakasından çıkarın ve 3.4'te açıklandığı gibi PBS'deki planktonik hücreleri durulayın. Sonraki OD₆₀₀ analizi için meydan okuma plakasının altını saklayın (bkz. 4.10).
8. Durulamadan sonra, peg kapağını biyofilm geri kazanım ortamını içeren plakanın tabanına yerleştirin.
9. Plakanın yan tarafını parafin film ile sarın, çevre kuyucuklarının dibini tıkamamaya dikkat edin. Plakayı sardıktan hemen sonra, plaka okuyucuya yerleştirin ve adım 4.1'den daha önce yapılmış resazurin kinetik protokolünü başlatarak 24 saatlik bir süre boyunca kinetik bir okuma başlatın.
10. Meydan okuma sırasında meydana gelebilecek veya gelmeyebilecek planktonik hücrelerin büyümesini ölçmek için, bir mikroplaka okuyucu kullanarak tüm meydan okuma plakası tabanının OD_600'ünü okuyun. Adım 3.8.
    'da verilen talimatları izleyin Not: Biyofilmden dökülen hücreler kuyu dibinde kümeler halinde büyüme eğiliminde olduğundan, her bir kuyucuğun içeriğini dikkatlice yeniden askıya alın. Kuyu içindeki herhangi bir kabarcık, OD₆₀₀ okumalarını güçlü bir şekilde engelleyecektir ve okumadan önce kaçınılmalı veya çıkarılmalıdır.

Sonuçlar

Şekil 1. Meydan okuma plakası düzeni. Altı farklı konsantrasyonda üç kopya halinde dört bileşiğin paralel testini barındıran meydan okuma plakasının örnek düzeni. İşlenmemiş ve sterilite kontrolleri de dahildir. Yerleşim tasarımı, çok kanallı bir pipet kullanarak seri seyreltmelerin uygun şekilde plaka içi hazırlanmasını destekler. Konsantrasyonlar μM cinsindendir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Mueller-Hinton Orta	Oksoit	CM0405	Üreticinin tavsiyelerine uyun
RPMI-orta	Corning	17-105-Özgeçmiş
CRPMI (İngilizce)	Kaynak 9		RPMI-1640 orta boy şeleks, Chelex 100 reçine ile 1 saat süreyle şelekslenir ve ardından %10 kaside edilmemiş RPMI-1640 ile desteklenir
Chelex 100 Reçine	Biyo Rad	142-2822
MBEC plakaları	Innovotech	19111
Resazurin Sodyum Tuzu	Sigma	R7017	DI su filtresinde 800 μg/ml
Mikro Plaka Çalkalama Platformu	Heidolph Titramax 1000
Cytation 3 Plaka Okuyucu	Biyotek
5. Nesil yazılım	Biyotek		Resazurin dönüşümünün kaydedilmesi ve analizi
Neocuproin (Neocuproine)	Sigma	N1501	% 100 Etanol içinde 10 mM stok hazırlayın, -80 ºC'de saklayın
Bakır sülfat	Acros Organik	7758-99-8	Suda 100 mM'lik bir stok çözeltisi hazırlayın, 4 ºC'de saklayın
Cu-Neocuproine	Self		Neocuproine ve bakır sülfatın eşit molaritelerinin karıştırılmasıyla üretilir. Karışım, CRPMI ortamında istenen konsantrasyona seyreltildi.
Gentamisin	Sigma	G3632-1G

Serisi teknolojisi Numaralı Beton Serisi steril Serisi