Plazma Membranının Yeniden Sızdırmazlık Verimliliğini Ölçmek için İn Vitro Floresan Bazlı Bir Test

Özet

Kaynak: Lam, J. G., et al. Memeli Hücrelerinde Plazma Zarı Yeniden Sızdırmazlık Verimliliğinin Yüksek Verimli Ölçümü. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, memeli hücrelerinde plazma zarının yeniden kapatılma verimliliğini incelemek için bir testi göstermektedir. Hücreler, hücre zarında gözenekler oluşturan bakteriyel gözenek oluşturan bir toksine maruz kalır. Hücre dışı kalsiyum iyonlarının varlığında, gözenek kalsiyum akışına neden olur ve zarın yeniden kapanması olaylarına neden olur. Yeniden mühürleme verimliliği, hücrelere yalnızca yeniden kapatılmış bir zar olmadan giren DNA bağlayıcı propidyum iyodür boyası kullanılarak değerlendirilir.

Protokol

1. Hazırlık

1. Hücre Kaplama
   not: Bu protokolde insan servikal epitel hücreleri, HeLa ve Histon 2B-GFP'yi (H2B-GFP) eksprese eden HeLa ve HeLa kullanılmıştır, ancak bu test diğer memeli hücrelerine uyarlanabilir.
   1. Hücreleri 2 mL Tripsin-EDTA %0.25 ile yıkayarak 75 cm'lik² hücre kültürü şişesinden yapışık hücreleri ayırın. Kullanılmış tripsini 2 mL taze tripsin-EDTA ile değiştirin.
   2. Hücreleri 37 ° C'de 5 dakika boyunca hücreler yuvarlanana ve şişeden ayrılana kadar inkübe edin.
   3. Hücreleri 8 mL büyüme ortamında (% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin içeren DMEM) yeniden süspanse edin.
   4. Bir hemositometre ve 10 μL hücre süspansiyonu kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin.
   5. Hücreleri bir büyüme ortamında 2.5 x 10⁵ hücre / mL konsantrasyona seyreltin.
   6. Hücre süspansiyonunu steril bir pipet kabına dökün ve süspansiyonu 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak iyice karıştırın.
   7. 12 çok kanallı bir mikropipet ve 200 μL'lik uçlar kullanarak, HeLa hücrelerini (2.5 x 10⁴ hücre / 100 μL / oyuk) 96 oyuklu düz, şeffaf dipli, siyah polistiren doku kültürü ile muamele edilmiş bir plakada üçlü (veya dörtlü) olarak dağıtın.
      not: Şekil 1'de örnek olarak bir kaplama düzenlemesi sunulmuştur.
   8. Hücreleri 37 ° C ve% 5 CO_2'de nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 24 saat boyunca kültürleyin.
2. Stok Çözeltisi Hazırlama
   1. 95 g Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi, 0.476 g MgCl₂ (5 mM) ve 23.83 g HEPES (100 mM) ekleyerek 10x tampon M stoğundan 1 L hazırlayın (M1 ve M2'yi hazırlamak için kullanılır) 900 mL suya. PH'ı 7,4'e ayarlayın ve hacmi 1 L'ye yükseltin. Filtre sterilize edin.
   2. Toplam 50 mL suya 11.26 g D- (+) - Glikoz ekleyerek 50x (1.25 M) glikoz stoğundan 50 mL hazırlayın. Filtre çözeltiyi sterilize eder.
   3. Toplam 50 mL suya 0.666 g CaCl₂ ekleyerek 50 mL 100x (120 mM) kalsiyum stoğu hazırlayın. Filtre çözeltiyi sterilize eder.
   4. 40 mL suya 0.951 g EGTA ekleyerek 50 mL 10x (50 mM) etilen glikol-bis (2-aminoetileter) -N, N, N', N', tetraasetik asit (EGTA) stoğu hazırlayın. EGTA'yı çözmek için NaOH kullanarak pH'ı 8'e yükseltin, ardından hacmi 50 mL'ye yükseltin. Filtre çözeltiyi sterilize eder.
   5. Tek bir 96 oyuklu plaka için, 50 mL Orta 1 (M1, Ca²⁺ içerir), 50 mL Orta 2 (M2, Ca²⁺ içermez) ve EGTA ile desteklenmiş 15 mL Orta 2 hazırlayın, buna göre:
      1. M1 için, 43.5 mL suya 5 mL 10x Tampon M, 0.5 mL 100x_CaCl2 ve 1 mL 50x glikoz ekleyin.
      2. M2 için, 44 mL suya 5 mL 10x Tampon M ve 1 mL 50x glikoz ekleyin.
      3. M2/EGTA için 12 mL suya 1,5 mL 10x Tampon M ve 1,5 mL 10x EGTA ekleyin.
         not: Promidyum iyodür (PI) içeren tüm çözeltiler, hücrelere eklenmeden hemen önce hazırlanmalıdır.
3. Plaka Okuyucu/Görüntüleme Sitometresi Ayarları
   not: İki algılama ünitesiyle donatılmış çok modlu bir plaka okuyucu kullanın: bir spektroflorometre ve bir görüntüleme sitometresi. Floroforların foto-ağartılmasını önlemek için floresan maruziyetini sınırlayın.
   1. Testi gerçekleştirmeden önce plaka okuyucuyu 37 °C'ye önceden ısıtın.
   2. Kinetik tahlil için parametreleri Ayarlar modunda uygun şekilde ayarlayın:
      1. Optik yapılandırma, okuma modları ve okuma türü için sırasıyla Monokromatörü, FL (floresan) ve Kinetik'i seçin.
      2. Dalga Boyu Ayarları altında, sırasıyla 9 ve 15 nm uyarma ve emisyon bant geçişi seçin. Promidyum iyodür (PI) kullanan tahliller için, uyarma ve emisyon dalga boylarını sırasıyla 535 ve 617 nm'ye ayarlayın.
      3. Plaka Tipi altında, plaka formatı için 96 Kuyu ve siyah duvarlı şeffaf bir alt plakaya karşılık gelen önceden ayarlanmış bir plaka konfigürasyonu seçin.
      4. Okuma Alanı altında, kinetik boyunca analiz edilecek kuyuları vurgulayın.
      5. PMT ve Optik altında, okuma başına yanıp sönmeyi 6'ya önceden ayarlayın ve Alttan Oku kutusunu işaretleyin.
      6. Zamanlama altında, 30 dakikalık kinetik test için Toplam Çalışma Süresi kutusuna 00:30:00 değerini girin ve Interval.
         için 00:05:00 değerini girin Not: Her zaman noktası ve bir dalga boyu için, tam 96 oyuklu bir plakanın okuma süresi 30 s'dir.
      7. Sağdaki Ayarlar Bilgileri'nde belirtilen ayarları onaylayın ve Tamam'ı seçin. Kinetik çalışmayı başlatmak için Oku'ya basın.
   3. Ayarlar modunda görüntüleme parametrelerini uygun şekilde ayarlayın:
      1. Optik yapılandırma, okuma modları ve okuma türü için sırasıyla Minimax, Imaging ve Endpoint'i seçin.
      2. Dalga boyları altında, iletilen ışığı ve 456/541 nm (GFP) ve 625/713 nm (PI) uyarma ve emisyon dalga boylarına karşılık gelen floresan kutularından birini veya her ikisini seçin.
      3. Plaka Tipi ve Okuma Alanı için adım 1.3.2.3 ve 1.3.2.4'te tanımlanan seçeneklerin aynısını kullanın.
      4. Kuyu Alanı Ayarı altında, görüntülenecek bir kuyu içindeki site sayısını seçin.
         Not: 12 site tam kuyu görüntüsüne karşılık gelir.
      5. Görüntü Alma Ayarları altında, iletilen ışık, 541 (GFP) ve 713 (PI) için pozlama sürelerini seçin. GFP için, 20 ms/görüntü pozlama süresiyle tüm kuyuyu görüntüleyin. İletilen ışık (TL) ve PI floresansı için, sırasıyla 8 ve 20 ms'lik maruz kalma süreleriyle her bir kuyucuğun merkezinin tek bir görüntüsünü elde edin.
      6. Sağdaki Ayarlar Bilgileri'nde belirtilen ayarları onaylayın ve Tamam'ı seçin. 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunun tüm yüzeyini (12 görüntü/kuyu) ve bir dalga boyu için görüntüleme süresi ~15 dakikadır. Görüntülemeyi başlatmak için Oku'ya basın.
         Not: 96 oyuklu bir plakanın tek bir görüntüsünün / kuyusunun elde etme süresi, bir dalga boyu için ~ 2.5 dakika / plaka gerektirir. Yukarıda açıklanan parametreler laboratuvarımızdaki özel ekipmanlara karşılık gelir. Spektroflorometrik ölçümler: Ayarlanabilir 9 veya 15 nm bant geçişli 1,0 nm artımlı uyarma dalga boylarını (250-850 nm) gösteren bir ksenon flaş lambası, > 6 log dinamik aralığa sahip bir fotoçoğaltıcı tüp dedektörü ve ayarlanabilir 15 veya 25 nm emisyon bant geçişi. Görüntüleme sitometresi: 20 nm bant geçişli beyaz ışık, 460 nm ve 625 nm uyarma dalga boyları, sırasıyla 541 nm (108 nm bant geçişi) ve 713 nm (123 nm bant geçişi) merkezli emisyon filtreleri ve 1,25 megapiksel 12 bit şarj bağlantılı cihaz kamerasına bağlı 4X objektif.

2. Tahlil

Not: Tahlil sırasında hücrelerin %70-90 oranında birleşik olması gerekir. Yıkama adımları sırasında, ortam kuyucuğun yan duvarından çıkarılmalı ve uygulanmalıdır (doğrudan hücrelerin üzerine değil). Adım 4'e kadar toplanmasını önlemek için LLO'nun sıcaklığını 3.1.5 °C'de < tutun.

1. M30'de 1 μM PI'lik bir stok ve 30 °C'de önceden ısıtılmış M2'de 37 μM PI'lik bir stok hazırlayın.
2. Plaka 1'deki hücreleri 12 çok kanallı bir mikropipet ve 200 μL uçlar kullanarak aşağıdaki gibi nazikçe yıkayın:
   1. Onarım izin verilen koşullar için, büyüme ortamını çıkarın ve hücreleri 37 ° C'de önceden ısıtılmış 200 μL / kuyu M1 ile iki kez yıkayın. Ortamı 30 μM PI içeren 100 μL / kuyu ılık M1 ile değiştirin.
   2. Onarım kısıtlayıcı koşullar için, büyüme ortamını çıkarın ve hücreleri bir kez Ca²⁺ şelatlamak için 5 mM EGTA içeren 200 μL / iyi ılık M2 ile yıkayın, ardından 200 μL / kuyu M2 ile bir yıkama yapın. Ortamı 30 μM PI içeren 100 μL/iyi ısınmış M2 ile değiştirin.
   3. Büyüme ortamı yıkandıktan ve propidyum iyodür içeren ortam ile değiştirildikten sonra, doğrudan adım 2.1.3'e geçin.
3. 1.3.3 (ön kinetik) altında ayrıntılı olarak açıklandığı gibi iletilen ışık, GFP ve PI altında görüntü plakası 1. Bu işlem 15-20 dk sürer.
4. Adım 2.1.3'teki 15 dakikalık süre boyunca, 12 çok kanallı bir mikropipet ve 200 μL uçlar kullanarak plaka 2'yi aşağıdaki gibi hazırlayın:
   1. Buzun üzerine 96 oyuklu yuvarlak tabanlı bir polipropilen mikroplaka yerleştirin. Plakayı, plaka 1'e karşılık gelen deneysel bir tasarım kullanarak yapılandırın (Şekil 1).
   2. Onarıma izin veren koşullar için, 60 μM PI içeren 100 μL/kuyucuk buz gibi M1 ekleyin, ardından kontrol için 100x LLO içeren 1 μL/kuyu buz gibi soğuk M4 ekleyin veya ekleyin.
   3. Onarım kısıtlayıcı koşullar için, 60 μM PI içeren 100 μL/kuyucuk buz gibi soğuk M2 ekleyin, ardından kontrol için 100x LLO içeren veya 2x LLO içeren 4 μL/kuyu buz gibi soğuk M2 ekleyin.
5. Plaka 1'i görüntüledikten sonra (adım 2.1.3), plakayı buzla doğrudan temastan ayırmak için alüminyum folyo kullanarak hemen buzun üzerine yerleştirin. Plaka 1'i 5 dakika soğumaya bırakın.
6. 12 çok kanallı bir mikropipet ve 200 μL'lik uçlar kullanarak, her bir oyuktan 100 μL'yi plaka 2'ye (adım 2.1.4) plaka 1'deki karşılık gelen kuyucuklara aktarın. Toksini plaka 1'in ortamına düzgün bir şekilde dağıtmak için, uçları menisküsün altına yerleştirin ve kabarcıklar oluşturmadan hacmi nazikçe çıkarın.
   Not: Hücreleri yanlışlıkla ayırabileceğinden yukarı ve aşağı pipetlemeyin.
7. Toksinin hücrelere bağlanmasına izin vermek için plakayı 1 dakika daha bırakın ve spektroflorometre modunu kullanarak kinetik test için plaka 1'i hemen plaka okuyucuya aktarın (adım 1.3.2).
8. Kinetik testin sonunda, adım 1.3.3'ü kullanarak hemen plaka 1'i (kinetik sonrası) görüntüleyin.

3. Analiz: Hücre Numaralandırma

1. Mikroplaka hücre numaralandırma yazılımını kullanarak nükleer floresansa dayalı hücre sayısını belirleyin.
   1. Ayarlar içinde Yeniden analiz'i seçin ve Görüntü Analizi Ayarları'ndaki kategori bölümünün altında, nesneleri bulmak için dalga boyu olarak 541'i kullanarak Gizli Nesne Analizi'ni seçin.
   2. Nesneleri Bul seçeneğinde, Görüntüler Üzerine Çiz bulma yöntemini kullanarak, ayarlar sekmesi altında Nuclei'yi seçin ve Uygula'ya basın.
   3. Hücre sayma algoritmasını başlatmak için Tamam ve Oku'ya basın.

Sonuçlar

Şekil 1: Deney tasarımı. Akış diyagramı, tedavi edilmemiş hücrelerin kontrolüne kıyasla yedi test koşulunun etkisini test etmek için yapılandırılmış temsili bir plaka tasarımını göstermektedir. Uygunsa, örneğin uyuşturucu araçlarında olduğu gibi ek kontroller dahil edilmelidir. Hücreler deneyden 24 saat önce kaplanır (plaka 1). Deney gününde, plaka 1'deki hücreler, 37 ° C'de önceden ısıtılmış M1 veya ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
SpectraMax i3x Çok Modlu Mikroplaka Okuyucu	Moleküler Cihazlar	i3x (i3x)
MiniMax 300 Görüntüleme sitometresi	Moleküler Cihazlar	5024062
İLE-PRO-3	ThermoFisher Bilimsel	T3605
Propidyum İyodür	ThermoFisher Bilimsel	P3566 Serisi
Hela	ATCC (Uzay Servisi)	CCL2
HeLa H2B-GFP	Kırlangıç	SCC117
Tripsin-EDTA %0.25	ThermoFisher Bilimsel	25200056
96 oyuklu Corning düz tabanlı siyah polistiren doku kültürü ile muamele edilmiş plaka	Corning	3603
Hanks'in dengeli Tuzları	Sigma-Aldrich	H4891
EGTA (EGTA)	ISC Biyoekspres	0732-100G
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Balıkçı Bilimsel	BP310-500
D-(+)-Glikoz, HybriMax	Sigma-Aldrich	G5146-1KG

Serisi Serisi Serisi Gazetesi Serisi Serisi Gazetesi Serisi