Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Dokuların formalin fiksasyonu
- Nekropsi sonrası toplanan 3-5 mm'lik beyin dokularını 24 h.
için% 10 fosfat tamponlu formalin çözeltisine (1:20 ila 1:50 doku / formalin oranı) yerleştirin
Dikkat: Formalin toksik bir fiksatiftir.
- Yaklaşık doku ağırlığını (boyutu), doku tipini (beyin bölgeleri) ve formalin hacmini kaydedin. Laboratuvarların fiksasyon süreleri ile ilgili kayıtları belgelemesi ve muhafaza etmesi önemlidir.
- Formalin fiksasyonundan sonra ve işlemden önce daha uzun doku depolaması için dokuyu %70 etanole yerleştirin.
2. Doku işleme
- Numune fiksasyonunu takiben, dokuyu önemli beyin alanlarını, örneğin beyin sapının, beyinciğin (3 lob) veya hipokampusun (her ikisi de hipokampus) her biri 3 ila 5 mm kalınlığında kesilmiş ve işleme kasetlerine yerleştirilmiş olacak şekilde inceleyin.
- Parafin mumu infiltrasyonu için doku kasetlerini işleyin, parafin bloklarına gömülü ve bir mikrotom üzerinde bölümlere ayırın (3 ila 6 μm).
3. Malzemelerin Hazırlanması / Bulaşıkların Boyanması
- Boyama kabını (Malzeme Tablosu) Şekil 1'de gösterildiği gibi ayarlayın. Her tabağı 250 mL çözelti ile doldurun.
- 3-Amino-9-etilkarbizol (AEC) substrat stok çözeltisinin hazırlanması
- Bir 20 mg tablet 3-amino 9-etilkarbazol (AEC) bir cam pipet kullanarak 5 mL N, N, dimetilformamid içinde çözün.
Dikkat: AEC kanserojendir.
- Antijen alımı için proteaz (örn., Pronaz) stok çözeltisinin hazırlanması
- 7 mg proteazı 200 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözün
.
- Durulama tamponu PBS-T'nin hazırlanması
- 10 mL Tween 80 ila 990 mL PBS ekleyin. Homojen bir çözelti elde edene kadar iyice karıştırın.
4. Deparafinizasyon ve doku rehidrasyonu
- Bir mikrotom kullanarak 5 μm'lik bir parafin bölümü yapın, 38 ° C'de bir su banyosunda yüzdürün ve cam slaytlara toplayın. Slaytları reaktife dayanıklı bir kalem/işaretleyici ile etiketleyin.
- Slaytları bir tepsiye yerleştirin ve 55-60 °C fırında 1 saat eritin. Viral antijeni yok edebileceği için sıcaklığı 60 ° C'nin üzerine çıkarmayın.
- Slaytları fırından çıkarın ve 1, 2 ve 3. tabaklarda her biri 5 dakikalık 3 ardışık ksilen durulamasında hemen deparafinize edin.
- Etanolün deiyonize suya seyreltilmesini azaltarak sıralı daldırmalarla slayt üzerindeki bölümleri yeniden sulandırın: (4 ila 11 arası bir daldırma durulamasıdır) Çanak 4: Ksilen/%100 etanol (1:1); Çanak 5: %100 etanol; Çanak 6: %100 etanol; Çanak 7: %95 etanol; Çanak 8: %95 etanol; Çanak 9: %80 etanol; Çanak 10: %70 etanol; Tabak 11: deiyonize su (Şekil 1. Çanak kurulumu).
Dikkat: Ksilen tehlikeli bir kimyasaldır ve çalışma çeker ocakta yapılmalıdır.
5. Proteolitik antijen alımı
- Tabak 12'de proteolitik antijen alımı için slaytları proteaz (2.5 μg / mL PBS) ile 30 dakika tedavi edin.
- Daha sonra PBS-T'de 10 dakika durulayın (bulaşık 13).
- 10 dakika boyunca% 3 hidrojen peroksit ile muamele edin (tabak 14).
- Tekrar PBS-T ile 10 dakika yıkayın (bulaşık 15).
6. Boyama prosedürü
- Slaytları teker teker tutun, kalan slaytları arabelleğe batırılmış halde tutun (tüm slayt tutucuyu çıkarmayın - slaytları ıslak tutun). Bir slaytı çıkarın ve doku bölümünü rahatsız etmemeye dikkat ederek doku bölümünün etrafındaki fazla tamponu (bir kağıt havlu kullanarak) kurulayın. Slaytları, nemli kağıt havluların yerleştirilmesiyle yapılan bir nem odasında, oda sıcaklığında laboratuvar tezgahının üzerine normal keçi serumu (blokaj) ile 15 dakika inkübe edin.
- Optimal önceden belirlenmiş seyreltme primer anti-kuduz antikoru (fare anti-kuduz serumunun 1:250 seyreltilmesi, yayınlanmamış) (pozitif kontrol) ve negatif kontrol antikorları ile oda sıcaklığında yukarıdakiyle aynı (adım 6.1.) 60 dakika boyunca arada yıkama olmadan.
- 60 dakika sonra PBS-T ile 10 dakika yıkayın (bulaşık 16).
- Biyotinile antikor (türe özgü) ile oda sıcaklığında bir nem odasında 15 dakika inkübe edin (işlem adım 6.1 ile aynıdır).
- PBS-T ile 10 dakika yıkayın (bulaşık 16).
- Streptavidin-yaban turpu peroksidaz (HRP) kompleksi ile oda sıcaklığında bir nem odasında 15 dakika inkübe edin (6.1. ile aynı).
- PBS-T ile 10 dakika yıkayın (bulaşık 16).
- Peroksidaz substratı, amino-etilkarbazol (AEC) ile oda sıcaklığında bir nem odasında 10 dakika inkübe edin. Kullanmadan hemen önce AEC yapın. Bunu yapmak için, 14 mL 0.1M asetat tamponuna, pH 5.2'ye 1 mL AEC stok çözeltisi ekleyin. 0.15 mL% 3 peroksit, H2O2 ekleyin. Karışımı kullanmadan hemen önce süzün (0,45 μm filtre).
not: AEC'nin çalışma çözeltisi sadece 2-3 saat stabildir. AEC stok çözeltisi buzdolabında daha uzun süre saklanabilir.
- Deiyonize suda 10 dakika yıkayın (bulaşık 17)
- 2 dakika boyunca deiyonize su ile 1:2 oranında seyreltilmiş Gill'in Hematoksilen ile karşı boyanmıştır (tabak 18).
- Fazla Hematoksilin'i deiyonize suya daldırarak durulayın (bulaşık 19 ve 20).
- Scott'ın Musluk suyunda 30 saniye durulayın (mavileştirme solüsyonu) kabı 21.
- Deiyonize suda 10 dakika yıkayın (bulaşık 22)
- Slaytları teker teker çıkarın - suda çözünür bir montaj ortamıyla monte edin.
- Işık mikroskobunda slaytları okuyun.
