$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Temporal Arter Biyopsisi Alındıktan Sonra Histopatolojik Hazırlık ve İşleme
NOT: Temporal arter biyopsisi (TAB) lokal anestezi altında ve steril koşullar altında sertifikalı bir cerrah tarafından yapılır. Daha fazla etkilenen tarafta cerrahi olarak 3 cm'lik bir arteriyel kesit elde edildikten sonra, numune hemen 24 saat boyunca formalin içinde sabitlenir, 3 ila 4 mm'lik bölümlere ayrılır ve parafin içine gömülür, daha sonra oda sıcaklığında saklanan bloktaki dokunun uygun şekilde hizalanmasına dikkat edilir. Numune seçimi, tıbbi kayıtlar doğrulandıktan sonra gerçekleştirilir. Tanı, Amerikan Romatoloji Koleji 1990 kriterlerine dayanmaktadır ve deneklerin 5 alandan 3'ünü yerine getirmesini gerektirir: yaş >50 yıl, yeni baş ağrısı, temporal arter hassasiyeti, Westergren yöntemiyle eritrosit sedimantasyon hızı >50 mm / saat ve anormal bir TAB. Güvenlik için, numuneleri tutarken her zaman koruyucu eldiven giyilmelidir, kimyasallar ve antikorlar.
- Gömülü bloklardan bir mikrotom kullanarak 4-5 μm kalınlığında kesitler kesin ve Hematoksilen ve Eozin (H & E) ile boyayın. Kalite güvencesi için seçilen normal dokunun bir kontrol bölümünü kullanın.
- Kırışıklıkları gidermek için kesilmiş bölümleri 40 °C'ye ısıtılmış ılık su banyosunda yüzdürün ve kaplanmış cam mikroskobik bir slaytla toplayın. Bölümün kurumasını ve slayta yapışmasını kolaylaştırmak için cam slaytları 60 °C fırında 60 dakika boyunca ılık bir tabağa koyun.
- Bölümün kurumasını ve slayta yapışmasını kolaylaştırmak için cam slaytları 60 °C fırında 60 dakika boyunca ılık bir tabağa koyun.
- Mikroskop slaytlarına 3 bölüm monte edin.
- Slaytları dikey bir rafa yerleştirin ve gece boyunca 37 °C'de 24 saat kurutun.
- Slaytları bir kaba koyun ve 4 °C'de saklayın.
2. İmmünohistokimyasal Hazırlama, Mum Alma, Antijen Alımı ve Boyama
- Slaytları bir kaydırma rafına yükleyin. Rafı bulaşıklardan aşağıdaki gibi geçirin: Her 30 saniyede bir 10 saniye hafif çalkalama ile 5 dakika boyunca% 100 ksilen içinde iki kez, 10 saniye çalkalama ile% 100 etanolde bir kez, 10 saniye çalkalama ile% 90 etanolde bir kez, 10 saniye çalkalama ile% 70 etanolde bir kez ve 10 saniye çalkalama ile çift damıtılmış H2O'da iki kez.
not: Ksilen ve asetonun kullanımı, soluma ve solunum toksisitesini önlemek için havalandırmalı davlumbazlarda yapılmalıdır.
- Rafı 200 mL 10 mmol/L, pH 6.0 sitrat tamponu 95 °C'ye önceden ısıtılmış bir cam kaba aktararak antijeni geri alın. Zamanlayıcıyı su banyosunda 30 dakikaya ayarlayın, ardından oda sıcaklığında 20 dakika soğutun ve ardından 5 dakika akan su ile durulayın.
- 200 mL% 3 hidrojen peroksit içinde 10 dakika inkübe ederek endojen peroksidaz aktivitesini çıkarın. Slaytları 200 μL Tris tamponlu tuzlu su çözeltisinde (TBSS) 3 kez yıkayın.
- Slaytları raftan çıkarın ve fazla tamponu silmek için her birine hafifçe vurun. Boyama için, aşağıdaki primer antikorlardan 200 μL ekleyin, slaytlara lameller ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat nemli bir odada inkübe edin:
Anti-folat reseptörü beta (FRB) antikoru 1:800
seyreltilmiş
Monoklonal fare anti-insan CD68, 1:200 seyreltme
Poliklonal tavşan anti-CD3 1:100 seyreltme
not: Plasentanın formalinle sabitlenmiş parafine gömülü bölümleri de Adım 2.1 ila 2.9'da belirtildiği gibi işlendi ve anti-FRB18 ile inkübe edildi ve pozitif bir kontrol olarak kullanıldı. Boyama sonuçları, optimal antikor konsantrasyonunun bulunmasıyla elde edildi ve antikorun çift dilüsyonlarda titre edilmesiyle gerçekleştirildi (ör., 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600).
- İnkübasyondan sonra lameli çıkarın ve atın. Slaytları TBSS ile her biri 2 dakika boyunca 3 kez durulayın, boşaltın ve fazla tamponu silin.
- Doku antijenine bağlı konjuge olmayan primer antikor ile reaksiyona girmek için biyotinile Anti-Tavşan / Fare ikincil antikoru içeren 200 μL ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Lamelleri slaytların üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında 45 dakika nemli bir odada inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra lameli çıkarın ve atın. Slaytları TBS ile her biri 2 dakika boyunca 3 kez durulayın, boşaltın ve fazla tamponu silin.
- 200 μL diaminobenzidin (DAB) + substrat tamponu (İmidazol HCl) -kromojen sistemi ekleyin ve boyama modelini görselleştirmek için 10 dakika inkübe edin. TBSS ile yıkayın, ardından 10 dakika boyunca akan musluk suyunda yıkayın.
- 3 dakika boyunca hematoksilen ile lekeleyin.
- Kızağın yüzeyine 70 μL montaj ortamı uygulayarak kızakları monte edin. Lameli yavaşça montaj aracına eğin ve yerine indirirken kabarcık oluşturmaktan kaçının. Kuruması için 24 saat bekleyin.
3. Histopatolojik ve İmmünohistokimyasal (IHC) Analiz
GCA pozitif ve normal deneklerden H&E ve IHC ile boyanmış kesitleri ışık mikroskobu kullanarak inceleyin.
- H & E lekeli bölümler için
- Vasküler mimariyi değerlendirin ve tunika intimadaki endotel hücrelerini, tunika ortamındaki düz kas hücrelerini ve tunika adventitia'daki fibroblastları ve vasa vasorumu tanımlayın.
- Lenfosit ve makrofaj/histiyosit infiltrasyonu, hücresel hiperplazi ve iç elastik lamina bozulmasını içeren GCA özelliklerini tanımlayın.
- Lenfositlere göre makrofajların sayısını belirleyerek ve ölçerek lenfohistiyositik infiltrasyonu analiz edin. Yerleşik hücrelerde iç elastik lamina bozulmasının ve hiperplastik değişikliklerin derecesini değerlendirin ve bunları kontrollerle karşılaştırın.
- IHC lekeli bölümler için
- FRB'nin boyama modelini inceleyin, belirli bir hücre tipi veya türleri tarafından ekspresyonunu ve vasküler katmanlar içindeki dağılımını ve toplam immün infiltrat, toplam makrofaj belirteci, anti-CD68 ve pan lenfosit belirteci anti CD3 ile ilişkisini not edin.
- FRB, CD68 ve CD3 hücrelerinin ekspresyonunu, rastgele seçilmiş 10 çoklu yüksek güç alanında (hpf) pozitif lekeli hücreleri sayarak ölçün ve ortalamaları kaydedin.
not: Bu normal ve patolojik hücre ve yapıların tanımlanması sertifikalı kardiyovasküler patolog ve romatolog tarafından yapıldı ve sonuçlar tüm olgular için kaydedildi.
- Dijital kamera kullanarak temsili görüntüler yakalayın.
NOT: Bu adımlardan sonra kalan alikotlar -80 °C'de saklanabilir.