$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Doku Toplama ve UV Çapraz Bağlama
- 2 yetişkin fareyi karbondioksit (CO2) kullanarak 1-2 dakika veya solunum durana kadar ötenazi yapın. Ardından, her farede servikal çıkık gerçekleştirin.
- Her immünopresipitasyon deneyi için uygun yaştaki farelerden (bu çalışmada bir yetişkin testis) yaklaşık 100 mg testis toplayın ve dokuları buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) içine yerleştirin.
- Tunika albuginea'yı bir çift ince uçlu cımbızla nazikçe çıkarın.
- Bir doku öğütücüye 3 mL buz gibi soğuk PBS ekleyin ve gevşek bir cam havaneli (A tipi cam havaneli) kullanarak dokuyu hafif mekanik kuvvetle ezin.
NOT: Bu adımın amacı hücreleri parçalamak değil, dokuyu ayırmaktır. Hücre canlılığının ve bütünlüğünün korunması önemlidir.
- Doku süspansiyonunu bir hücre kültürü kabına (10 cm çapında) aktarın ve 6 mL'ye kadar buz gibi soğuk PBS ekleyin.
- Plakayı hızlı bir şekilde çalkalayın, böylece sıvı tabağın altını eşit şekilde kaplar. Doku düzgün bir şekilde öğütülürse, eşit olarak dağılmış seminifer tübüller görünür olurken, doku kümelerinin varlığı doku dağılımının yetersiz olduğunu gösterir.
- Süspansiyonu buz üzerinde 254 nm'de 400 mJ/cm2 ile üç kez çapraz bağlayın. Her ışınlama arasında süspansiyonu karıştırın.
not: Her yeni deney için çapraz bağlama optimize edilmelidir.
- Süspansiyonu 15 mL'lik bir konik tüpte toplayın ve peleti 1,200 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca toplayın. Süpernatanı çıkarın, peleti 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin ve ardından süspansiyonu 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. 4 ° C ve 1.000 x g'da 2 dakika döndürün ve süpernatanı çıkarın.
- Bu noktada, hemen protokolün geri kalanına devam edin veya peletleri sıvı nitrojen içinde dondurun ve kullanılana kadar -80 °C'de saklayın.
2. Boncuk Hazırlama
- Taze bir santrifüj tüpüne numune başına 125 μL protein A manyetik boncuk (pelet) ekleyin.
not: Fare antikorları için protein G manyetik boncukları kullanın.
- Boncukları çözeltiden ayırmak için tüpü mıknatısın üzerine yerleştirin. 10 saniye sonra süpernatanı çıkarın. Boncukları 1 mL buz gibi soğuk lizis tamponu ile iki kez yıkayın.
not: Protein A manyetik boncuklarının daha sonra ayrılması bu adımı takip eder. Lizis tampon bileşimi 50 mM Tris-HCl, pH 7.5'tir; 100 mM NaCl; % 1 NP-40; % 0.1 SDS; % 0.5 sodyum deoksikolat; 1/50 etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içermeyen proteaz inhibitörü kokteyli (taze ekleyin).
- Boncukları 10 μg eCLIP antikoru ile 100 μL soğuk lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Tüpleri oda sıcaklığında 45 dk.
döndürün
not: İmmünopresipitasyon için son antikor konsantrasyonu 10 μg/mL'dir. Antikor konsantrasyonu bilinmiyorsa, antikor miktarı optimize edilmelidir.
- Boncukları 1 mL buz gibi soğuk lizis tamponu ile iki kez yıkayın.
3. Doku Parçalanması ve Kısmi RNA Sindirimi
- Doku peletlerini 1 mL soğuk lizis tamponunda yeniden süspanse edin (1 mL lizis tamponuna 22 μL 50x (EDTA) içermeyen protein inhibitörü kokteyli ve 11 μL RNaz inhibitörü ekleyin).
- Deney grubu başına iki UV çapraz bağlı peleti ve iki çapraz bağlı olmayan peleti yeniden süspanse edin: eCLIP kitaplığı (UV-1) için UV çapraz bağlı-1 peletler; eCLIP kitaplığı (UV-2) için UV çapraz bağlı-2 peletler; kontrol olarak eCLIP kitaplığı için çapraz bağlı olmayan-1 peletler (UV olmayan); antikorların özgüllüğünü göstermek için IgG IP için çapraz bağlı olmayan 2 peletler.
not: UV çapraz bağlı geniş tip testislerin eCLIP kütüphanesi için ideal kontrol, aynı çöpteki farelerden alınan UV çapraz bağlı nakavt testislerinin kontrolüdür.
- Numuneleri 15 dakika boyunca buz üzerinde parçalamaya devam edin (protein ve RNA'nın bozulmasını önlemek için).
- Dijital sonikatörde 5 dakika boyunca% 10 genlikte, 30 s açık / 30 s kapalı. Numuneyi her zaman buzun üzerine yerleştirin ve probu her numune arasında nükleaz içermeyen su ile temizleyin.
- Her tüpe 4 μL DNaz ekleyin ve iyice karıştırın. 37 °C'de 10 dakika inkübe edin, 1.200 rpm'de çalkalayın.
- 10 μL seyreltilmiş RNase I (PBS'de 4 U/μL RNase I) ekleyin ve iyice karıştırın. 37 °C'de 5 dakika inkübe edin, 1.200 rpm'de çalkalayın.
- Lizatı 20 dakika boyunca (4 ° C'de) 15.000 x g'da santrifüjleme ile temizleyin.
- Süpernatanı dikkatlice toplayın. 50 μL lizat bırakın ve peleti onunla birlikte atın.
- Giriş örneklerini RWB (western blot için çalıştır) ve RRI (RNA izolasyonu için çalıştır) olarak kaydedin. RWB jel yüklemesi için girdi olarak UV-1, UV-2, UV olmayan ve IgG örneklerinden 20 μL (%2) tasarruf edin. RRI jel yüklemesi için girdi olarak 20 μL (%2) UV-1 veya UV-2 numunesi kaydedin.
4. İmmünopresipitasyon
- Boncuklara (bölüm 2'de hazırlanan) 1 mL lizat (adım 3.7'den itibaren) ekleyin ve numuneleri 2 saat veya gece boyunca 4 ° C'de döndürün.
- Boncukları manyetik bir stand ile toplayın ve süpernatanı atın. Boncukları 900 μL yüksek tuz tamponu (50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 M NaCl; 1 mM EDTA; %1 NP-40; %0.1 SDS; %0.5 sodyum deoksikolat) ile iki kez yıkayın ve ardından boncukları 900 μL yıkama tamponu (20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 10 mM MgCl2; %0.2 Tween-20) ile iki kez yıkayın.
not: IgG numunesi için prosedürü burada duraklatın ve bir yıkama tamponunda buz üzerinde saklayın.