1. Ortam ve boyama çözeltisinin hazırlanması
- Komple Ortam Hazırlayın: 2 mM glutamin, 100 U/mL penisilin / streptomisin, 50 μM beta-merkaptoetanol ve% 10 hacim / hacim (v / v) fetal sığır serumu (FBS) içeren Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamı
- Boyama Tamponu Hazırlayın: % 1 ağırlık / hacim (a / v), sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu (EDTA) ile Ca2 + / Mg2 + (PBS) içermeyen fosfat tamponlu salin
2. Fare tedavisi
- İnsan immün yetmezlik virüsünün (HIV) kuadrisepslerine intramüsküler (i.m.) enjeksiyonla 7-8 haftalık dişi Balb / c fareleri-1-gag eksprese eden şempanze adenoviral vektörü (ChAd3-gag) 107 viral partikül dozu ile.
- Astarlamadan 1-4 ay sonra, fareleri bir kez HIV-1-gag eksprese eden modifiye vaccinia Ankara virüsü (MVA-gag) 106 plak oluşturan birim dozunda enjekte ederek artırın.
- Takviyeden sonraki 3. günde, takviye edilmiş fareleri servikal çıkık ile feda edin ve tedavi edilmemiş farelerle paralel olarak analiz edin.
- Kuadrisepsleri (iliak, popliteal ve inguinal) ve dalakları boşaltan lenf düğümlerini (LN'ler) güçlendirilmiş ve tedavi edilmemiş farelerden hasat edin. Ayrıca, tedavi edilmemiş farelerden alınan iki arka bacaktan kemik iliğini (BM) toplayın ve bu BM'yi akış sitometresi ayarları için ve hücre döngüsü analizi için pozitif kontrol olarak kullanın (Şekil 1).
not: Daha önce açıklandığı gibi ChAd3-gag ve MVA-gag vektörleri oluşturun.
3. Drenaj LN, dalak izolasyonu
- Dalak ve LN hücrelerinin izolasyonu
- İki adet 15 mL'lik tüpün her birine 5 mL tam ortam yerleştirin ve organların toplanması için hazır olacak şekilde buz üzerinde tutun.
- Servikal çıkık ile yetişkin bir fareyi feda edin.
- Fareyi sırt üstü yatırın ve cilt yüzeyini %70 v/v etanol ile sterilize edin.
- Kasık LN'lerini toplamak için karın bölgesinde makasla ~1 cm boyuna bir kesi yapın ve kesiyi forseps ile gerin.
- Cildin iç yüzeyindeki kasık LN'lerini görselleştirin ve forseps ile hasat edin. Kasık LN'lerini adım 3.1.1'de hazırlanan iki adet 15 mL'lik tüpten birine yerleştirin.
- Dalağı toplamak için makasla peritoneal bir kesi yapın ve dalağı çıkarın. Çevreleyen bağ dokusunu kestikten sonra, dalağı adım 3.1.1'de hazırlanan ikinci 15 mL'lik tüpe yerleştirin.
- İliak LN'leri toplamak için bağırsakları bir kenara çekin ve inferior vena kavaya yakın iliak LN'leri görselleştirin ve ardından forseps kullanarak toplayın. İliak LN'leri kasık LN'lerini içeren aynı tüpe yerleştirin.
not: Boyama için yeterli LN hücresi elde etmek için (bkz. bölüm 4), genellikle bir fareden popliteal, inguinal ve iliak LN'leri bir araya getirmek gerekir. Bu LN'lerin tümü kuadrisepsleri boşaltıyor (i.m. aşılama bölgesi). Bu protokol yalnızca bir adet 15 mL'lik havuzlanmış LN tüpü kullanır.
- Popliteal LN'leri toplamak için, arka bacakların derisini kavrayın ve kasları ortaya çıkarmak için yavaşça aşağı doğru çekin. Daha sonra forsepsleri diz ekleminin altındaki kaslar arasına yerleştirin ve popliteal LN'leri toplayın. Popliteal LN'leri inguinal ve iliak LN'leri içeren aynı tüpe yerleştirin.
not: 3.1.7'den sonraki nota bakın.
- Dalağı, 5 mL tam ortamla doldurulmuş 60 mm'lik bir kültür kabı içinde 70 μm'lik bir hücre süzgecine yerleştirin. 5 mL'lik bir şırınga pistonu kullanarak, organı tamamen ayrılana kadar hafifçe ezin.
- Süzgeci çıkarın ve hücre süspansiyonunu 15 mL'lik temiz bir tüpe aktarın.
- Kültür kabına 5 mL tam ortam ekleyin ve tüm hücrelerin geri kazanıldığından emin olmak için kabı ve süzgeci dikkatlice yıkayın. Dalak hücresi süspansiyonunun geri kalanıyla birlikte 15 mL'lik tüpe koyun.
- Havuzlanmış inguinal inguiak ve popliteal LN'ler için, dalak için 3.1.9 ila 3.1.11 adımlarında kullanılana benzer bir prosedürü izleyerek tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın.
- Hücreleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletlerini PBS'de yeniden süspanse edin.
- PBS'de kırmızı kan hücresi lizis tamponu ve% 0.04 v / v tripan mavisi kullanarak bir Neubauer odası ile hücreleri sayın.
4. Dalak lekelenmesi, LN
- Boyanacak hücre örneklerini 3 alt gruba ayırın: yalnızca Hoechst 33342 (bundan böyle Hoechst olarak anılacaktır) ile boyanacak tedavi edilmemiş farelerden alınan BM hücreleri dahil olmak üzere telafi için hücre örnekleri ve tedavi edilmemiş farelerden alınan dalak hücreleri dahil olmak üzere ölü / canlı hücre telafisi için ölü / canlı hücre karışımı hazırlamak üzere kullanılacaktır; tedavi edilmemiş farelerden alınan bir BM örneğinden oluşan hücre döngüsü analizi için pozitif kontrol; ve tedavi edilmemiş ve aşılanmış farelerden alınan dalak ve LN örneklerini içeren deneysel örnekler.
not: Yeterli sayıda gag'a özgü CD8 T hücresinin analizi için yeterli dalak ve LN hücresi olduğundan emin olun. Genellikle 3 aşılanmış fareden havuzlanmış dalak hücreleri ve havuzlanmış LN hücreleri kullanmak ve her biri 3 ila 106 hücre içeren iki veya daha fazla aynı havuzlanmış hücre örneğini boyamak × gereklidir. Hoechst boyama adımında aynı numuneleri birleştirin. Benzer şekilde, tedavi edilmemiş 3 fareden havuzlanmış dalak hücrelerini ve LN hücrelerini boyayın ve sonunda aynı örnekleri birleştirin. Alet ve kompanzasyon kurulumu için kullanılmak üzere tedavi edilmemiş bir fareden boyanmamış bir dalak hücresi örneğini bir kenara koyun.
- Ölü hücre boyası telafisi için ölü/canlı hücre karışımını hazırlayın (bu hücre karışımı sadece ölü hücre boyası ile boyanacaktır).
- Bir su banyosunu 65 °C'de ısıtın.
- Dalak hücrelerinin bir alikotunu alın (~ 3 × 106).
- Hücre süspansiyonunu bir mikrofüj tüpüne aktarın, 5 dakika boyunca 65 ° C'de su banyosuna yerleştirin ve ardından hemen 10 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
- Isıyla öldürülen hücreleri canlı dalak hücreleriyle (~ 3 × 106) 1: 1 oranında karıştırın ve karışımın yarısını 96 iyi yuvarlak bir alt plakaya aktarın (~ 3 × 106 hücre / ölü hücre boyama kontrolü için kuyu
).
- Deneysel örneklerin ölü hücre boyama, hücre döngüsü analizi için pozitif kontrol ve ölü/canlı hücre karışımı
- dalak, LN, BM hücrelerini (3 × 106 hücre/oyuk) ve ölü/canlı hücre karışımını (bölüm 4.2) boyama şemasına göre (adım 4.1) 96 oyuklu yuvarlak tabanlı bir plakaya aktarın ve 400 × g'da 4 ° C'de 3 dakika santrifüjleyin.
- Her hücre peletini PBS'de seyreltilmiş 50 μL ölü hücre boyası içinde yeniden süspanse edin ve hemen 3 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin.
- Işıktan koruyarak 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- Hücreleri boyama tamponu ile 2 kez yıkayın; ilk kez 200 μL ile ve ikinci kez 250 μL ile. Her yıkama için plakayı 400 × g'da 4 °C'de 3 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve hücre peletini 20 μL PBS'de yeniden süspanse edin.
- Majör histouyumluluk kompleksi (MHC)-peptit multimerleri ve monoklonal antikorlar (mAb'ler) ile membran hücre boyama.
- Boyama şemasına göre gerekli hacimleri dikkate alarak (Akış sitometresi ayarları, Tablo 1), aşağıdaki reaktifleri hazırlayın:
- Boyama tamponunda mAb 2.4G2'yi uygun seyreltmeye göre seyreltin (Malzeme Tablosuna bakınız); boyanacak her numune için bu seyreltmeden 10 μL kullanın.
NOT: 2.4G2 mAb, immünoglobulinlerin FcγIII ve FcγII reseptörlerine antijene özgü olmayan bağlanmasını bloke eder.
- Uygun seyreltmeyi elde etmek için H-2k (d) AMQMLKETI allofikosiyanin (APC) etiketli tetrameri (Tetr-gag) boyama tamponunda seyreltin (bkz. Malzeme Tablosu); boyanacak her numune için bu seyreltmenin 20 μL'sini kullanın.
- Antikor karışımını, daha önce titrasyon deneylerinde belirlenmiş olan uygun seyreltmeye göre boyama tamponunda mAbs'yi seyrelterek hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız); boyanacak her numune için bu antikor karışımından 20 μL kullanın.
not: Burada anti-CD3e peridinin klorofil proteini (PerCP-Cy5.5) (klon 145-2C11), anti-CD8a parlak ultraviyole (BUV805) (klon 53-6.7) ve anti-CD62L fikoeritrin siyanin7 (PECy7) (klon MEL-14) kullanıldı.
- Önceden seyreltilmiş 2.4G2 mAb'den 10 μL ekleyin (adım 4.4.1.1) ve ışıktan koruyarak 4 °C'de 10 dakika inkübe edin.
- 20 μL önceden seyreltilmiş Tetr-gag APC (adım 4.4.1.2) ve 10 μL H-2k(d) AMQMLKETI fikoeritrin (PE) pentamer (pent-gag) ekleyin. Işıktan koruyarak 4 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
- Önceden hazırlanmış antikor karışımından 20 μL ekleyin (adım 4.4.1.3) ve ışıktan korunarak 4 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
not: Bu nedenle, nihai hacim kuyu başına 80 μL'dir (adım 4.3.5, adım 4.4.2 ila 4.4.4).
- Hücreleri 200 μL boyama tamponu ile yıkayın. 400 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
- Hücre peletini 250 μL boyama tamponunda yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu 5 mL'lik tüplere aktarın. Tüpe 1 mL boyama tamponu ekleyin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleyin.
- Hoechst kanalını telafi etmek için kullanılacak BM hücrelerinin (3 × 106 hücre) alikotunu alın (Hoechst 33342 bir ultraviyole lazer tarafından uyarılır (akış sitometresi ayarları (Tablo 2)) ve hücre süspansiyonunu 5 mL'lik bir tüpe aktarın. Tüpe 1 mL boyama tamponu ekleyin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 × g santrifüjleyin.
>5. Fiksasyon/geçirgenlik
- Üreticinin talimatlarına göre 1 kısım fiksasyon/geçirgenleştirme konsantresini 3 kısım fiksasyon/geçirgenleştirme seyrelticisi ile seyrelterek yeni fiksasyon/geçirgenleştirme tamponu hazırlayın.
- Süpernatanı atın ve peleti tamamen ayırmak için numuneleri nabız şeklinde girdaplayın.
- Boyanmamış dalak hücreleri (3 x 106, hücre örnekleri listesine bakınız, bölüm 4.1) ve girdap içeren bir tüp dahil olmak üzere her tüpe 1 mL taze hazırlanmış fiksasyon/geçirgenlik tamponu ekleyin.
- 4 °C'de 16 saat inkübe edin.
not: Protokol buradan duraklatılabilir.
6. Hücre içi boyama
- Ki67 boyama
- Üreticinin talimatlarına göre geçirgenlik tamponunu 10x damıtılmış su ile seyrelterek taze geçirgenleştirme tamponu 1x hazırlayın. Kullanmadan önce, agregaları ortadan kaldırmak için geçirgenlik tamponu 1x 0,45 μm'lik bir filtreden süzülmelidir.
- mAb Ki67 floresein izotiyosiyanat (FITC) (klon SolA15) geçirgenlik tamponu 1x içinde seyreltin (Malzeme Tablosuna bakın), daha önce titrasyon deneylerinde belirlendiği gibi (numune başına 100 μL'lik nihai hacim).
- Her tüpe 3 mL geçirgenlik tamponu 1x ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve adım 6.1.3'ü tekrarlayın.
- Süpernatanı atın ve hücre peletini 100 μL önceden seyreltilmiş mAb Ki67 FITC (adım 6.1.2) içinde yeniden süspanse edin.
- RT'de ışıktan korunarak 30 dakika inkübe edin.
- Hücreleri 4 mL geçirgenlik tamponu 1x ile 2 kez yıkayın. Her yıkama için RT'de 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleyin.
- Aşağıdaki hacimleri göz önünde bulundurarak hücre peletini PBS'de yeniden süspanse edin: Doğrudan akış sitometresinde alınacak numuneler için 350 μL PBS; akış sitometrisinden kısa bir süre önce Hoechst ile inkübe edilecek numuneler için 250 μL PBS (bölüm 6.2).
- DNA boyama
- Her numuneye PBS'de 250 μL 4 μg/mL Hoechst ekleyin (Hoechst'in nihai konsantrasyonu 2 μg/mL'dir).
NOT: PBS'de 250 μL'lik iki veya daha fazla özdeş numunenin hazırlanması durumunda, bunları bu adımda birleştirin ve PBS'ye eşit hacimde 4 μg/mL Hoechst çözeltisi ekleyin (Hoechst'in nihai konsantrasyonu 2 μg/mL'dir). Hücre sayısı, DNA boyama adımını büyük ölçüde etkiler. Her örnekte aynı hücre numarasını kullanın. Biraz azaltılmış bir hücre sayısının bile (örneğin, önceki yıkama aşamalarındaki hücre kaybı nedeniyle) DNA'ya daha yüksek Hoechst bağlanması ve daha yüksek Hoechst yoğunluğu ile sonuçlandığını unutmayın.
- RT'de ışıktan korunarak 15 dakika inkübe edin.
- Numuneleri RT'de 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleyin.
- Hücre peletini 350 μL PBS'de yeniden süspanse edin.
7. Kompanzasyon boncuk numunelerinin hazırlanması
- Boyama tamponunda mAb'yi uygun şekilde seyrelterek 5 μL antikor hazırlayın.
not: Deneyde kullanılan her florokrom konjuge mAb için, karşılık gelen kompanzasyon boncuk örneğini hazırlayın.
- Kullanmadan önce Vorteks Negatif Kontrol ve Anti-Sıçan / Hamster Ig, κ Comp Boncuklar.
- Her numune için bir damla (~ 20 μL) Negatif Kontrol CompBeads ve bir damla Anti-Sıçan / Hamster Ig, k CompBeads ekleyin.
- Tüpe 5 μL önceden seyreltilmiş antikor (adım 7.1) ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Işıktan koruyarak 4 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
- Numuneleri 2 mL boyama tamponu ile yıkayın. 400 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve her tüpe ve girdaba 500 μL PBS ekleyerek peleti yeniden süspanse edin.
8. Akış sitometresinde alet ve kompanzasyon kurulumu ve deneysel numune alımı
>NOT: Sitometre konfigürasyonu için akış sitometresi ayarlarına (Tablo 2) bakın.
- Genel enstrüman ve kompanzasyon kurulumu
- Örnek alımı için yazılımı açın (Malzeme Tablosu'na bakın) ve çalışma alanı şerit bölümünde Yeni Deneme'ye tıklayıp Yeni Boş Deneme'yi seçerek yeni bir deneme oluşturun.
- Açmak için oluşturulan deneye çift tıklayın.
- Sitometre Ayarları penceresinde, Parametreler'e tıklayın ve İleri Dağılım (FSC) ve Yan Dağılım (SSC) parametreleri dahil olmak üzere boyama panelinde kullanılan tüm kanalları (örn. PE, APC, vb.) seçin.
- Günlük ölçeğinin işaretini kaldırarak Hoechst parametresi olarak doğrusal ölçeği seçin ve FCS, SSC ve Hoechst.
için voltaj darbesinin Genişliğini (W) kontrol edin
not: Doğrusal ölçekte olan FSC ve SSC dışında tüm parametreler varsayılan olarak logaritmik (log) ölçekte gösterilir. Tüm parametreler, voltaj darbesinin Alanı (A) ve Yüksekliği (H) ile analiz edilir.
- Genel Çalışma Sayfası'nda, x ekseninde FSC-A ve y ekseninde SSC-A ile bir nokta grafiği oluşturun.
- Alım Panosu'nda Veri Al'a tıklayarak lekelenmemiş dalak örneğini çalıştırın.
- Parametreler bölümündeki voltaj değerlerini değiştirerek hücreleri görselleştirmek için uygun FSC ve SSC ayarlarını yapın ve Global Çalışma Sayfasının çalışma alanı araç çubuğundaki Polygon Gate'e tıklayarak FSC-A/SSC-A nokta grafiğinde görüntülenen tüm hücreleri seçmek için bir kapı oluşturun.
- Geçitli hücreleri, her bir floresan parametresi x ekseninde olacak şekilde histogramlarda görüntüleyin.
- Floresan dedektörünü (PMT) her floresan parametresi için lekeli hücrelerin negatif ve pozitif sinyalleri arasında net bir ayrım yapacak şekilde ayarlamak için lekelenmemiş ve tamamen lekeli dalak örneklerini çalıştırın.
- Ücret kurulumunu gerçekleştirmek için çalışma alanı şeridinde Deneme'ye tıklayın ve Ücret Kurulumu bölümünün altında Ücret Denetimleri Oluştur'u seçin. Lekesiz Kontrol Tüpünü/Kuyusunu Dahil Et seçeneğinin işaretini kaldırın ve Tamam'a tıklayın.
not: Bu işlem, Kompanzasyon Kontrolleri adlı bir örneğin ve seçilen her parametreye karşılık gelen birkaç sayfa içeren bir Normal Çalışma Sayfasının oluşturulmasıyla sonuçlanacaktır.
- Kompanzasyon boncuklarının bir örneğini çalıştırın (bkz. bölüm 6); Sitometre penceresindeki FSC parametrelerinde voltaj değerlerini ve 5.000 edinme eşiğini değiştirerek boncukları görselleştirmek için uygun FSC ve SSC ayarlarını yapın.
- Boncuk popülasyonundaki P1 kapısını ayarlayın ve pozitif ve negatif tepe noktalarının her ikisinin de x ekseninde görünür olduğunu kontrol edin. Her telafi boncuğu örneği için bu işlemi yineleyin ve son olarak Alım Panosu'nda Verileri Kaydet'e tıklayarak her örnek dosyasını kaydedin (her örnek için en az 5.000 olay kaydedin).
- Kaydedilen her boncuk örneği için, P2 ve P3 kapılarını sırasıyla pozitif ve negatif tepe noktalarına ayarlayın.
- Telafi için hücre örneklerini çalıştırın (bkz. adım 4.2 ve 4.4.7 ile bölüm 5 ve 6). Hücreleri görselleştirmek, P1 kapısını ayarlamak ve son olarak her bir örnek dosyasını kaydetmek (en az 10.000 olay kaydetmek) için FSC ve SSC voltajlarını ve eşik değerini değiştirin. P2 ve P3 kapılarını sırasıyla pozitif ve negatif tepe noktalarına ayarlayın.
not: Hoechst kanalının telafisi için, negatif tepe noktası (P0) olarak G 1/G3 ve pozitif tepe (P2) olarak G 2/M'yi kullanın.
- Çalışma alanı şeridi bölümünde Deneme'ye tıklayın ve Ücret Kurulumu bölümünde Tazminatı Hesapla'yı seçin.
- Oluşturulan ücret ayarını, bağlantısını adlandırın ve geçerli denemeye kaydedin.
- Deneysel örnek alımı
- Tarayıcı araç çubuğunda Yeni Örnek'e tıklayarak bir örnek açın ve Genel Çalışma Sayfasında geçit stratejisini oluşturun.
not: Numune alımının geçit stratejisi, Şekil 2 ve Bölüm 9'da açıklanan numune analizine benzer.
- X ekseninde CD3-A ile tüm Olay popülasyonlarını bir histogramda görüntüleyin. Yalnızca CD3+ hücrelerini seçmek için bir Aralık Kapısı oluşturun.
- Edinme Panosu'nda, LN örnekleri için Tüm Olaylar olarak depolama kapısını ve dalak örnekleri için Tüm Olaylar veya CD3+ hücreleri olarak seçin.
- Deneysel örnekleri düşük hızda çalıştırın ve son olarak aşılanmış farelerden alınan her örnek için en az 100-200 antijene özgü CD8 T hücresi topladığınızdan emin olarak tüm dosyaları kaydedin.
not: Deneysel örneklerin dosya boyutu genellikle büyüktür (30-120 MB), özellikle antijene özgü CD8 T hücrelerinin frekansı düşük olduğunda. Bu nedenle, en az 100-200 antijene özgü CD8 T hücresini kaydetmek için yüksek sayıda olay (> 1 × 106) toplanmalıdır. Büyük dosyalar sonraki veri analizi sürecini yavaşlatabilir. Dalak örneklerinde yalnızca CD3+ hücrelerinin alınması (yukarıdaki adım 8.2.2'ye bakın) dosya boyutunu daha küçük tutmaya yardımcı olur.
- Hücre döngüsü analizi, yani tedavi edilmemiş farelerden alınan BM örneği için pozitif kontrolü çalıştırın ve kaydedin.
9. Veri Analizi
- Yazılımı açın (Malzeme Tablosuna bakın) ve çalışma alanı şeridi bölümünde Grup Oluştur'a tıklayarak analiz edilecek farklı organlara karşılık gelen farklı gruplar oluşturun (yani, "a-LNs"; "b-dalak"; "c-BM" grubu oluşturun).
not: Yeni oluşturulan gruplar grup listesinde görünürken, "Tazminat" grubu yazılım tarafından otomatik olarak oluşturulur.
- Grup adına çift tıklayarak Grubu Değiştir penceresini açın ve yeni oluşturulan grupların senkronize olup olmadığını kontrol edin. Değilse, Senkronize işlevine bir onay işareti koyun.
- Her bir .fcs dosyasını ilgili gruba sürükleyin.
- "a-LNs" grubundan başlayarak geçit stratejisini oluşturun.
- Grafik penceresini açmak için gruptaki tamamen lekeli örneğe çift tıklayın; x ve y ekseni fcs dosyalarındaki gibi etiketlenmiştir (bkz. akış sitometresi ayarları, Tablo 2).
- Bu örnek için elde edilen toplam olayları, x ekseninde DNA-A ve y ekseninde DNA-W ile bir nokta grafiğinde görüntüleyin.
- Grafik penceresinin geçit aracı bölümündeki Dikdörtgen'e tıklayarak yalnızca tek hücre popülasyonunu seçin.
not: Tek hücrelerin DNA-A değerleri aşağıdaki gibidir: 2N (düşük): 2N ile 4N (orta) arasında veya 4N'ye (yüksek) eşitken, DNA-W değerleri hepsi için aynıdır (Şekil 2'nin 1. adımı).
- X ekseninde FSC-A parametresi ve y ekseninde ölü hücre boyası ile bir nokta çiziminde tek hücreleri görüntülemek için dikdörtgen kapının ortasına çift tıklayın.
- Grafik penceresinin geçit aracı bölümündeki Çokgen'e tıklayarak yalnızca canlı hücre popülasyonunu seçin. Canlı hücreler ölü hücre boyası için negatiftir (Şekil 2'nin 2. adımı).
- Hücreleri, x ekseninde FSC-A parametresi ve y ekseninde SSC-A parametresi ile bir nokta çiziminde görüntülemek için çokgen geçidin ortasına çift tıklayın.
- Dikdörtgen'e tıklayın ve bu grafikteki tüm tek canlı hücreleri dahil etmek için "rahat" bir kapı oluşturun (Şekil 2'nin 3. adımı).
- Hücreleri x ekseninde CD3 ve y ekseninde CD8 olacak şekilde bir nokta grafiğinde görüntülemek için "gevşek" kapının ortasına çift tıklayın.
- Polygon'a tıklayarak CD3+CD8+ hücrelerini seçin (Şekil 2'nin 4. adımı).
- CD3+CD8+ kapısının ortasına çift tıklayarak hücreleri x ekseninde Tetr-gag ve y ekseninde Pent-gag ile bir nokta grafiğinde görüntüleyin.
- Polygon'a tıklayarak antijene özgü CD8 T hücrelerini (hem Tetr-gag hem de Pent-gag için pozitif) seçin (Şekil 2'nin 5. adımı).
- Hücreleri, x ekseninde DNA-A ve y ekseninde Ki67 ile bir nokta grafiğinde görüntülemek için gag'a özgü kapının ortasına çift tıklayın (Şekil 3).
- Grafik penceresinin geçit aracı bölümündeki Dörtlü'ye tıklayarak farklı hücre döngüsü aşamalarındaki hücreleri seçin.
not: G0 fazındaki hücreler Ki67neg-DNA düşük hücreleridir (sol alt kadran); G1'deki hücreler Ki67pos-DNA düşüktür (sol üst kadran); S-G2/M'deki hücreler Ki67pos-DNA ara/yüksek (sağ üst kadran) şeklindedir (Şekil 3).
- Kapıları grubun tüm örneklerine uygulamak için bir örnekte oluşturulan geçit stratejisini ilgili gruba kopyalayın.
- "a-LN grubu" için 9.5 ila 9.18 arasındaki adımları tekrarlayın.
- "b-dalak" grubunun her bir numunesi için tüm kapıların uygun olduğunu kontrol edin. BM hücreleri arasındaki hücre döngüsünü analiz etmek için (pozitif kontrol), hücreleri x ekseninde DNA-A ve y ekseninde Ki67 ile bir nokta grafiğinde görüntülemek için "gevşemiş" kapının ortasına tıklayın.
- 3 grubun her bir örneği için tüm kapıların uygun olduğunu kontrol edin (yani, dalak, LN ve BM hücreleri için).
not: Tek hücreli popülasyon kapısı (adım 9.7) ve hücre döngüsü için Dörtlü kapı (adım 9.17), esas olarak numuneler arasındaki Hoechst boya yoğunluğunun olası küçük farklılıklarına bağlı olarak (bölüm 6.2) farklı numunelerde farklı kapı koordinatlarına sahip olabilir. Bu nedenle, her örnekte hücre döngüsü için Tek hücreli popülasyon kapısını ve Dörtlü kapıları değiştirmek gerekebilir. Bu şu şekilde yapılacaktır: grup adına çift tıklayın ve senkronizasyonu grup özelliklerinden kaldırın. Bu işlem, grubun diğer tüm örneklerinde aynı kapıları değiştirmeden bir numunedeki kapıların değiştirilmesine izin verir. Senkronizasyon kaldırıldıktan sonra, gerektiğinde kapıları değiştirin.
- Bu analizle elde edilen sonuçları görselleştirmek için, açmak üzere çalışma alanı şeridi bölümündeki Düzen Düzenleyicisi'ne tıklayın. Örnek bölmesindeki geçit stratejisinin her bir geçidini düzen düzenleyicisine sürükleyin ve grafikleri geçit stratejisinin sırasına göre yerleştirin. Gerekirse, mizanpajdaki ilgili çizime çift tıklayarak ve Grafik Tanımı penceresinde uygun Türü seçerek grafik türünü değiştirin.
- Grup'a tıklayın ve her organda elde edilen sonuçları görselleştirmek ve farklı örnekleri karşılaştırmak için düzen şeridindeki işlevlere göre yineleyin.
Tablo 1: Akış sitometresi ayarları.
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
)
Serisi
)
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
| örnek | Antikor paneli | | | | | | |
| Tam lekeli | Ki67 FITC | CD3 PercpCy5.5 | Tetr-gag APC | FVD eFluor 780 | Hoechst 33342 | CD8 BUV805 | Beşeli PE |
| Ki67 FMO (Radyo Frekansı) | | CD3 PercpCy5.5 | Tetr-gag APC | FVD eFluor 780 | Hoechst 33342 | CD8 BUV805 | Beşeli PE |
| Tetr-gag APC FMO | Ki67 FITC | CD3 PercpCy5.5 | | FVD eFluor 780 | Hoechst 33342 | CD8 BUV805 | Beşeli PE |
| Pent-gag PE FMO | Ki67 FITC | CD3 PercpCy5.5 | Tetr-gag APC | FVD eFluor 780 | Hoechst 33342 | CD8 BUV805 | |
| CD8 FMO (FMO | Ki67 FITC | CD3 PercpCy5.5 | Tetr-gag APC | FVD eFluor 780 | Hoechst 33342 | | Beşeli PE |
| CD3 FMO (FMO | Ki67 FITC | | Tetr-gag APC | FVD eFluor 780 | Hoechst 33342 | CD8 BUV805 | Beşeli PE |
| Sabitlenebilir Canlılık Boya FMO | Ki67 FITC | CD3 PercpCy5.5 | Tetr-gag APC | | Hoechst 33342 | CD8 BUV805 | Beşeli PE |
| Hoechst 33342 FMO | Ki67 FITC | CD3 PercpCy5.5 | Tetr-gag APC | FVD eFluor 780 | | CD8 BUV805 | Beşeli PE |
Tablo 2: Akış sitometresi ayarları.
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
| enstrüman | BD LSR Fortessa |
| lazer | Mavi 488nm | Kırmızı 639nm | UV 355nm | Sarı/yeşil 561nm |
| Bant geçiren filtreler | 530/30 | 710/50 | 670/14 | 780/60 | 530/30 | 820/60 | 585/15 | 780/60 |
| Uzun Geçiren Filtreler | 505 LP | 685 LP | | 750 LP | 505 LP | 770 LP | | 750 LP |
| Kullanılan florokromlar/Boya | FITC (Finans Finans Kurumu) | PERCPCY5.5 | Apc | eFluor 780 | Hoechst 33342 | BUV805 | Pe | PECY7 |
| fcs dosyalarında karşılık gelen ad | Alexa Flor 488 | PERCPCY5.5 | Apc | APC-H7 | Hoechst-Kırmızı | BUV737 | Pe | PECY7 |
