$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Enjeksiyon için Malzemelerin Hazırlanması
- 33 G'lik bir iğneyi ve şırıngayı sterilize edin: 115 οC'de sökün ve otoklavlayın. Steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yükselterek iğneleri enjeksiyona hazırlayın.
- Floresan etiketli parçacıkları oda sıcaklığında 5-10 dakika çözdürün. Kalsiyum iyonu ve magnezyum iyonu (Ca2 + / Mg2 +) ile steril PBS'de 50 mg / ml'lik bir çözeltiye sulandırarak partikül çözeltisini enjeksiyon için hazırlayın.
not: Bu protokolde fagositoz testleri için doğrulanmış AF488 etiketli mantar kökenli partiküller kullanılmaktadır. Optimum alım için, partikülleri taze ve enjeksiyondan hemen önce hazırlayın.
NOTLAR 2: Partikül konsantrasyonları her bir spesifik deney için optimize edilebilir.
2. Boncuk Çözeltisinin İntravitreal Enjeksiyonu
>NOT: Enjeksiyonu gerçekleştiren kişi fareyi tutabilecek ve göz küresi üzerindeki odağı koruyabilecek, diğer kişi ise yüklü şırıngayı geçip pistonu itecek şekilde enjeksiyonu gerçekleştirmek için iki kişi gereklidir.
- 20 μl/10 g vücut ağırlığı dozunda intraperitoneal 100 mg / ml ketamin ve 10 mg / ml ksilazin enjeksiyonu ile kemirgeni uyuşturun. Enjeksiyondan önce, anestezi seviyesini değerlendirmek için bir ayak parmağı tutamağı kullanın.
not: İzofluran, miyeloid hücre fonksiyonu üzerinde derin bir etkiye sahiptir, bu nedenle, bu test boyunca kullanımından kaçınılmalıdır.
- İğneyi 0,5 μl floresan etiketli partikül çözeltisi ile doldurun.
- Fareyi cerrahi mikroskop altında yan yatırın (Şekil 1A-B). Fareyi daha iyi konumlandırmak için yumuşak bir malzeme, örneğin bir jel paketi kullanın. Gözlerin henüz açılmadığı genç fareler için, göz kapaklarının sonunda açılacağı yarık boyunca bir çatlak oluşturarak ince 45o açılı forseps yardımıyla göz kapaklarını nazikçe açın.
- İnce 45o açılı forseps yardımıyla, göz kapağının etrafına dikkatlice baskı uygulayın, böylece göz küresi yuvadan hafifçe dışarı çıkar. Başınızı iki parmağınızla kulağın hemen üzerinde ve çenesinden tutun ve gözü yuvadan biraz uzak tutmak için cildi göz kapaklarına paralel olarak hafifçe gerin. Boğaza çok yakın tutmamaya dikkat edin (Şekil 1B).
- Göz küresini delmek için, şırınganın iğnesini kornea limpusuna (kornea ve skleranın bağlandığı yer) sokun. Bu, pigmentli farelerde gri bir daire olarak görülebilir. Küçük bir hacimde vitreus sıvısını dışarı atmak için iğneyi hafifçe geri çekin ve ardından enjekte edin. Enjeksiyonu yapan kişi bir eliyle fareyi, diğer eliyle iğneyi nazikçe tutmalıdır; İkinci kişi pistonu yavaşça itmelidir.
- Şırıngayı yavaşça geri çekin. Gözü nemli tutmak için göz nemlendirici damlalar uygulayın.
- Kemirgenin bir ısı yastığı üzerindeki bir kafeste iyileşmesine izin verin ve hayvanı izlemeye devam edin. Yavrularla çalışıyorsanız, hayvanı nefes alana ve kendiliğinden hareket edebilecek duruma gelene kadar diğer uyanık hayvanlarla birlikte bir kafese geri koymayın. Yetişkinlerle çalışıyorsanız, kemirgeni sternal yaslanma seviyesine geri dönene kadar diğer uyanık hayvanlarla birlikte bir kafese geri koymayın.
3. Retina Dokusunun Toplanması
>NOT: Floresan etiketli partiküller enjekte edilmeyen gözlerden alınan retina dokusu, akış sitometrik analizi için bir kontrol olarak toplanmalıdır. Test tek bir retina kullanılarak gerçekleştirilebilse de, en iyi performans için iki retina bir araya getirilmelidir.
- Floresan işaretli partiküllerin intravitreal enjeksiyonundan 3 saat sonra retina dokusunu toplayın.
not: Parçacık çözeltisinin enjeksiyonundan sonraki süre her bir spesifik deney için optimize edilebilirken, enjeksiyondan 3 saat sonra parçacık alımının retinanın çoğu katmanında görülebileceğini bulduk (Şekil 1C-D).
- Servikal çıkık ile fareleri feda edin.
- Göz küresini proptos yapmak için ince 45o açılı forseps yardımıyla göz kapağına hafifçe bastırarak göz kürelerini toplayın. Forsepsleri göz küresinin arkasına yerleştirin ve çekin.
- Retinayı diseksiyon mikroskobu altında inceleyin. Göz küresini Ca2 + / Mg2 + ile az miktarda PBS içeren bir Petri kabına aktarın. Petri kabının kuru bir bölgesinde, çok ince forsepslerin ucuyla kornea limpusundaki göz küresini delin.
- İnce 45o açılı forseps yardımıyla göz küresini tutun ve kornea limbus çevresinin kabaca yarısı kesilene kadar kornea limbusunun etrafını kesmek için yaylı makas kullanın.
- İnce 45o açılı forseps ile göz küresini tutun ve göz küresini PBS'ye getirin. İkinci bir çift ince 45o açılı forseps ile kornea ve sklerayı parçalar. Lens ve retina sağlam çıkacaktır.
- Lensi ve retinayı ayırın. Retinayı toplayın ve Ca2 + / Mg2 + ile 2 ml PBS içeren 5.4 ml'lik bir polistiren test tüpüne aktarın.
4. Tek Hücreli Bir Süspansiyonun Hazırlanması
- Üreticinin talimatlarında küçük değişiklikler yaparak bir nöronal doku ayrışma kiti kullanarak tek hücreli süspansiyonlar hazırlayın. Kısaca P1000 pipet ile yukarı ve aşağı pipetleyerek ve 37 oC'de sallamadan enzimatik bir sindirim gerçekleştirerek retinaları ezin.
5. Akış Sitometrik Analizi için Tek Hücreli Süspansiyonların Boyanması
- Hücreleri 200 μl boyama tamponunda (Dulbecco'nun %0.2 sığır serum albümini (BSA) ve %0.09 sodyum azid içeren fosfat tamponlu salini) yeniden süspanse edin ve U-tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın. 130 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
not: Sodyum azid insanlara ve çevreye zararlıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın ve atıkları yerel yönetmeliklere uygun olarak atın.
- Süpernatanı atmak için plakayı bir lavabonun üzerine ters çevirin. Fc reseptörlerini bloke etmek için, hücreleri oyuk başına 5 μg / ml anti-fare CD16 / CD32 antikoru içeren 25 μl leke tamponunda yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
- 0,5 μg/ml anti-fare Ly6C-APC-Cy7, 0,5 μg/ml anti-fare Ly6G-Pe-Cy7 ve 2,5 μg/ml anti-fare CD11b-BV650 içeren 25 μl boyama tamponu ekleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
- 130 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atmak için plakayı ters çevirin. Hücreleri 200 μl boyama tamponunda yeniden süspanse ederek yıkayın.
- 130 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. 0.5 μg / ml propidyum iyodür (PI) içeren 200 μl leke tamponunda yeniden süspanse edin. 1.2 ml mikrotitre tüplere aktarın.
- Kuyuları 0,5 μg/ml PI içeren 100 μl'lik ek bir boyama tamponu ile yıkayın ve önceki 200 μl ile 1,2 ml'lik mikrotitre tüplerinde havuzlayın. Toplam hacim 300 μl lekeli hücre elde edilir.
6. Akış Sitometrik Analizi
- Geleneksel bir üç lazer (mor, mavi ve kırmızı lazer) kullanarak, son derece parlak floresan AF488 parçacıklarından önemli ölçüde yayılma nedeniyle PE, PerCP-Cy5.5, BV510 ve PI boyalarından kaçının. Bu testi optimize etmek için dördüncü (sarı) bir lazer kullanın, çünkü PE etiketli antikorların ve PI'nin (PerCP-Cy5.5 kanalı yerine mCherry kanalında) kullanılmasına izin verir (Şekil 2).
not: Sarı bir lazer mevcut değilse, başka bir kanalda ölü hücre dışlama boyası kullanın.
- Ölü hücreleri dışlamak için PI negatif hücreleri (PI-) kapatın (Şekil 2B).
- Ölü hücreleri dışladıktan sonra, CD11b pozitif hücreleri (CD11b +) açın, bu tüm miyeloid hücreleri içerecektir (Şekil 2C).
- CD11b + popülasyonu içinde, nötrofilleri (CD11b + / Ly6G +) ve monositleri (CD11b + / Ly6C +; Şekil 2D). Mikroglia üzerinde geçit yaptıktan sonra (burada basitlik için CD11b+/Ly6C-/Ly6G- olarak tanımlanmıştır), iki net popülasyon görünür olmalıdır; floresan etiketli parçacıklar için bir negatif ve bir pozitif. Fagositik hücreler partikülleri almış olacak ve bu nedenle AF488+ olacaktır (Şekil 2E).
not: Bu boyama yaklaşımı kullanılarak partikül alımını ölçmek için Ly6C pozitif veya Ly6G pozitif popülasyonlar da analiz edilebilir. Fagositik CD11b + hücrelerinin yüzdesi, fagositik mikroglia yüzdesi ile iyi ilişkilidir (Şekil 2F). Akış sitometrisi deneyimi olmayan araştırmacılar için, tek başına CD11b boyama ile daha basit bir analiz yapılabilir, ancak bu, fagositik nötrofiller ve monositlerin yanı sıra mikrogliaları da içerecektir. Bu CD11b + / Ly6C- / Ly6G- popülasyonu içinde, bu hücreler, F4 / 80 ve CX3CR1 belirteçleri ile boyanarak değerlendirildiği gibi% 99 mikroglia >; Bu işaretler eklenebilir ancak elimizde gerekli değildir.
