$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
>NOT: Bu protokol taze veya donmuş izole edilmiş periferik kan hücreleri ve tam kan üzerinde test edilmiştir.
1. Hücre Boyama
>NOT: Neredeyse hiç spektral örtüşme olmayan florokrom çiftlerinin seçilmesi, diğer florokrom dedektöründeki bir florokromun yüksek oranda yayılması nedeniyle verilerin yayılmasını azaltmak için önemlidir. Tüm hücre alt kümelerinin optimal bir şekilde tanımlanmasını sağlamak için, antikor çiftleri PE-BV421 ve PE-APC gibi yüksek kuantum verimine sahip florokromlar kullanılmalıdır.
- Taze ve dondurulmuş PBMC'nin boyanması
- 100 μL PBMC'yi (1 x 106 hücreli) 96 oyuklu bir V tabanlı plakaya aktarın.
not: 1 x 106'dan daha düşük herhangi bir sayıda hücre benzer sonuçlarla kullanılabilir.
- RT'de 3 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin ve hücre peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice aspire edin. Ölü hücreleri etiketlemek için 10 dakika boyunca proteinler üzerinde serbest amin ile reaksiyona giren canlı/ölü sabitlenebilir bir boya içeren her bir oyuğa 100 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin.
- Her numune için tüm antikorları içeren bir karışımın 30 μL'sini hazırlayın (florokrom A'da anti-CD3. -CD56, TCRγδ ve florokrom B'de anti-CD4, CD8, CD19, CD14). Antikor konsantrasyonları Tablo 1 ve Tablo 2'de belirtilmiştir. Bu aşamada, farklı hedef moleküllere karşı ve farklı florokromlarda titre edilmiş antikorlar da eklenebilir (örneğin, Tablo 3).
not: Antikor konsantrasyonu, üreticiye ve lot numarasına bağlı olarak değişebilir. Bu nedenle, optimum sinyali elde etmek için ön testler yapılmalıdır. PBS, PBS/%0.5 sığır serum albümini (BSA), PBS/%0.2 sodyum azid veya PBS/%0.5 BSA/%0.1 sodyum azid, seyreltik antikorlar için benzer sonuçlarla kullanıldı. Hücreler ayrıca 30 μL'den farklı hacimlerde boyanabilir ve bu metodolojiyi mevcut boyama protokollerine kolayca entegre edebilir.
- RT'de 3 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin ve hücre peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice aspire edin. Antikor kokteylini her bir oyuğa ekleyin ve kabarcıklar oluşturmadan dikkatlice yeniden askıya alın. Karanlıkta RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
not: Numuneleri 4 °C'de benzer sonuçlarla boyamak mümkündür.
- 150 μL boyama tamponu ekleyin ve RT'de 3 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin ve hücre peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice aspire edin. Hücreleri 200 μL PBS'de yeniden süspanse edin ve bir akış sitometresinde veri elde edin. Boyama hacimleri değiştirilirse, lütfen fazla antikorları yıkamak için kullanılan orijinal antikor karışımının en az 20 kat seyreltildiğinden emin olun.
not: Lekeli hücreler PBS /% 2 paraformaldehit içinde sabitlenebilir, gece boyunca buzdolabında 4 ° C'de tutulabilir ve daha sonra ertesi gün bir akış sitometresinde elde edilebilir><.
Dikkat: Paraformaldehit yutulduğunda zararlıdır ve cilt tahrişine neden olabilir
2. Antikor Titrasyonu
NOT: Antikor titrasyonu, yüksek kaliteli, tekrarlanabilir veriler elde etmek için en kritik adımdır. Anti-CD3, -CD8, -CD14, -CD19 ve -TCR γδ titrasyonu, pozitif ve negatif pikleri en iyi şekilde ayırmak için antikor konsantrasyonunun maksimum boyama indeksi ile türetildiği standart prosedürü takip eder. Leke indeksi eğrisinin yükselen tarafında tepe noktasında veya tepe noktasına daha yakın seyreltmeler seçilmelidir (Şekil 1A-C). Anti-CD4 antikoru, CD8dim popülasyonlarını (CD8 + γδ T hücreleri ve NK T hücreleri) daha iyi ayırt etmek için CD3 tek pozitif popülasyonları ile CD3 + / CD8 + T hücreleri arasında, CD3 tek pozitif sinyaline daha yakın bir yerde CD4 pozitif popülasyonun zirvesini yerleştirmek için titre edilir. Aynı doğrultuda, CD56 titrasyonu, NK CD56+ hücrelerini CD3+ ve CD3- popülasyonu arasında konumlandırmayı amaçlar.
- Maksimum leke indeksi eğrisi
NOT: Anti-CD3, -CD8, -CD14, -CD19 ve -TCR γδ titrasyonu, pozitif ve negatif pikleri en iyi şekilde ayırmak için antikor konsantrasyonunun bir maksimum boyama indeksi eğrisi ile türetildiği standart prosedürü takip eder. Panele diğer belirteçlere karşı antikorlar eklenirse, bunların ayrıca maksimum boyama indeksi eğrisi ile titre edilmeleri gerekir.
- 96 oyuklu bir plakanın 10 oyusunu 40 μL boyama tamponu ile doldurarak 2 kat antikor seyreltmesi hazırlayın. İlk kuyucukta, son hacmi 80 μL boyama tamponuna yükseltin ve ilgilenilen antikoru, üretici tarafından önerilen konsantrasyonun 4 katı bir konsantrasyonda ekleyin.
- İyice karıştırın ve 40 μL'yi ikinci kuyucuğa aktarın. İyice karıştırın ve diğer tüm kuyucuklar için bu adımı tekrarlayın.
- Daha önce açıklanan protokolü izleyerek 10 PBMC veya tam kan örneğini 30 μL 10 farklı 2 katlı antikor dilüsyonu ile boyayın.
- Bir akış sitometresi ile veri elde edin ve her seyreltmeden gelen sinyali çizin (Şekil 1A).
- Her antikor konsantrasyonu için negatif ve pozitif popülasyonları açın. Antikor konsantrasyonunun arttırılması daha yüksek bir arka plana yol açabilir. Bu nedenle, negatif geçidi uygun şekilde yeniden boyutlandırın.
- Her antikor konsantrasyonu için, negatif popülasyonun floresan yoğunluğu için medyan ve standart sapma ve pozitif popülasyonun floresan yoğunluğu için medyan hakkında bilgi çıkarın. Her antikor konsantrasyonu için leke indeksini şu formülle hesaplayın: (pozitif popülasyonun medyan floresan yoğunluğu - negatif popülasyonun medyan floresan yoğunluğu) ÷ (negatif popülasyonun floresan yoğunluğunun 2 x standart sapması) (Şekil 1B).
- Antikor seyreltmesinin bir fraksiyonu olarak ifade edilen antikor konsantrasyonuna karşı leke indeksini çizin (ör., 1:10 seyreltme = 0.1) ve maksimum leke indeksi değeri ile antikor konsantrasyonunu tanımlayın (Şekil 1C).
- Anti-CD4 ve -CD56 antikor titrasyonu
NOT: Anti-CD4 ve -CD56 antikor titrasyonu, iki florokrom paneldeki diğer belirteçlerin önceki titrasyonuna dayanır. Anti-CD4 antikoru için titrasyon, anti-CD4 sinyalini çift CD8 + / CD3 + sinyali ile CD3 tek pozitif popülasyonu arasına yerleştirmeyi amaçlar (Şekil 1D).
- Anti-CD4 ve CD56 antikorlarını, daha önce tarif edildiği gibi 2 katlı bir seyreltme stratejisi ile titre edin, CD4 + T hücrelerini ve NK hücrelerini diğer hücre popülasyonlarından ayırmaya izin veren konsantrasyon aralığını ince bir şekilde tanımlamak için aralarına ek konsantrasyonlar ekleyin.
- Anti-CD4 sinyalini çift CD8 + / CD3 + sinyali ile CD3 tek pozitif popülasyonu arasına yerleştirerek anti-CD4 antikorunu titre edin (Şekil 1D).
not: CD4 + T hücrelerini CD8 + dim popülasyonlarından açıkça ayırmak için özel dikkat gösterilmelidir.
- Anti-CD56 antikorunu, anti-CD4 antikor titrasyonuna benzer bir strateji izleyerek, NK hücrelerini CD3-negatif ve CD3-pozitif popülasyonlar arasına yerleştirerek titre edin.
3. Geçit Stratejisi
- Lenfositik ve monositik hücre popülasyonlarını tanımlayın ve ölü hücreleri ve kalan kırmızı kan hücrelerinin çoğunu analizden çıkarın.
- İleri ve yan saçılma alanına (FSC-A ve SSC-A) dayalı olarak lenfositler ve monositler içeren tüm popülasyonu seçin. İleri saçılma yüksekliğine karşı ileri saçılma genişliği (FSC-H'ye karşı FSC-W) ve yan saçılma yüksekliğine karşı yan saçılma genişliğine (SSC-H'ye karşı SSC-W) aracılığıyla hücre agregalarını analizden çıkarın.
- Parlak pozitif ölü hücreleri ve artık kırmızı kan hücrelerini analizden çıkarmak için bir canlı/ölü ayrım işaretçisi kullanın. Farklı FSC-A ve SSC-A profillerine dayalı lenfositler ve monositler üzerinde geçit.
- Lenfositik popülasyonların iki florokrom yedi işaretli geçit stratejisi.
not: CD3 pozitif alt grubu içinde, CD4 +, CD8 + ve γδ T hücreleri, yalnızca CD4, CD8 ve γδ reseptörünü hedef alan antikorlar kullanılarak ayrılabilir. Karşılaştırılabilir bir şekilde, CD3 negatif alt grubu içinde, B hücreleri, NK hücreleri ve monositler, sırasıyla CD19, CD56 ve CD14'e karşı antikorlar kullanılarak benzersiz bir şekilde tanımlanabilir.
- Lenfosit kapısını seçin ve her eksende bu protokolde kullanılan iki florokromdan biri ile bir nokta grafiği oluşturun (Şekil 2B).
- Nokta grafiğinin sağ üst köşesinde CD3+/CD8+ çift pozitif hücreler olarak tanımlanan CD8+ T hücreleri üzerindeki kapı (Şekil 2B). NKT hücreleri içerebilecek dim CD8 popülasyonunu hariç tutun. CD4 + T hücreleri üzerindeki kapı, CD8 + T hücreleri ile CD3 tek pozitif popülasyonları arasında popülasyon olarak tanımlanır. Yüksek CD3 hücreleri olarak tanımlanan γδ T hücreleri üzerindeki kapı. γδ T hücrelerini CD8 pozitif ve CD8 negatif olarak alt bölümlere ayırın.
- CD3 pozitif ve CD3 negatif hücreler arasındaki popülasyon olarak tanımlanan NK hücreleri üzerindeki kapı. NK hücrelerini CD8 pozitif ve CD8 negatif olarak alt bölümlere ayırın. Nokta grafiğinin sağ alt köşesinde CD3-negatif CD19+ popülasyonu olarak tanımlanan B hücreleri üzerindeki kapı.
- Monosit kapılarını seçin ve her eksende bu protokolde kullanılan iki florokromdan biri ile bir nokta grafiği oluşturun (Şekil 2C). CD3-/CD14+ popülasyonunda kapı.
Tablo 1: PBMC'nin iki florokrom bağışıklık hücresi boyaması için kullanılan antikor paneli (BV421-PE kombinasyonu).
)
Serisi
Serisi
)
Serisi
)
Serisi
)
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
| hedef | Klon | Florokrom | satıcı | konsantrasyon | amaç |
| CD3 (İngilizce | UCHT1 | BV421 | Bd | 1/20 | soy |
| CD56 | NCAM16.2 (İngilizce | BV421 | Bd | 1/900 | |
| TCRγδ | B1 (İngilizce | BV421 | Biyo | 1/30 | |
| CD4 (İngilizce | RPA-T4 (İş Yükü) | Pe | Bd | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | Pe | Bd | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | Pe | Bd | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | Pe | Bd | 1/300 | |
| Ölü hücreler | | L/D Mavi | Lt | 1/300 | Canlı/Ölü ayrımı |
| BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Yaşam Teknolojileri |
Tablo 2: PBMC'nin (APC-PE kombinasyonu) iki florokrom bağışıklık hücresi boyaması için kullanılan antikor paneli.
)
Serisi
)
)
)
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
| hedef | Klon | Florokrom | satıcı | konsantrasyon | amaç |
| CD3 (İngilizce | UCHT1 | Apc | Bd | 1/20 | soy |
| CD56 | NCAM16.2 (İngilizce | Apc | Bd | 1/60 | |
| TCRγδ | B1 (İngilizce | Apc | Biyo | 1/30 | |
| CD4 (İngilizce | RPA-T4 (İş Yükü) | Pe | Bd | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | Pe | Bd | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | Pe | Bd | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | Pe | Bd | 1/300 | |
| Ölü hücreler | | L/D Mavi | Lt | 1/300 | Canlı/Ölü ayrımı |
| BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Yaşam Teknolojileri |
Tablo 3: Multipl miyelomlu bir hastadan donmuş PBMC'yi boyamak için kullanılan antikor paneli.
)
Serisi
Serisi
)
Serisi
)
Serisi
)
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
numaralı telefondan ulaşabilirsiniz.
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
Serisi
| hedef | Klon | Florokrom | katalog | satıcı | konsantrasyon | amaç |
| CD3 (İngilizce | UCHT1 | BV421 | 562426 | Bd | 1/20 | soy |
| CD56 | NCAM16.2 (İngilizce | BV421 | 562751 | Bd | 1/900 | |
| TCRγδ | B1 (İngilizce | BV421 | 331217 | Biyo | 1/30 | |
| CD4 (İngilizce | RPA-T4 (İş Yükü) | Pe | 555347 | Bd | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | Pe | 555367 | Bd | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | Pe | 555398 | Bd | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | Pe | 555413 | Bd | 1/300 | |
| CCR7 | G043H7 | AF647 | 353217 | Biyo | 1/30 | farklılaştırma |
| CD45RA | HI100 | APC-H7 | 560674 | Bd | 1/60 | |
| CCR4 | 1G1 | PE-CY7 | 561034 | Bd | 1/60 | Th alt kümeleri |
| CCR6 | G034-E3 | BV605 | 353419 | Biyo | 1/30 | |
| CXCR3 | 1C6/CXCR3 | AF488 | 561730 | Bd | 1/30 | |
| CD57 | NK-1 | PE-CF594 | 562488 | Bd | 1/900 | Aktivasyon / Tükenme |
| HLA-DR (Radyo Frekansı) | G46-6 | BV510 | 563083 | Bd | 1/30 | |
| CD16 | 3G8 | BUV395 | 563784 | Bd | 1/30 | NK, Monosit aktivasyonu |
| Ölü hücreler | L/D Mavi | L-23105 | Lt | 1/300 | Canlı/Ölü ayrımı |
