İmmün Hücrelerin Fenotipik ve Fonksiyonel Karakterizasyonu için Bir Barkodlama Testi

Abstract

Kaynak: Baxter, R. M., et al. Kütle Sitometrisi ile Periferik Tam Kanda İmmünofenotip ve Sitokin Üretiminin Tek Hücreli Analizi. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, farklı hücre barkodlaması için ağır metal konjuge antikorlar kullanan tek hücreli bir proteomik yöntemi vurgulamaktadır. Daha sonra, insan tam kan kaynaklı immün hücrelerdeki immün fenotipik ve fonksiyonel değişiklikleri değerlendirmek için immün boyama ve kitle sitometrisi uygulanır.

Protocol

1. Parçalanmış/Sabit Kan Hücrelerinin Barkodu

1. Parçalanmış / sabitlenmiş hücre örneklerini -80 ° C'lik depodan buz üzerinde yavaşça çözdürün; bu sistem kullanılarak en fazla 20 örnek benzersiz barkodlarla etiketlenebilir ve bir araya getirilebilir. 10X barkodlama perma arabelleğini PBS ile 1:10 oranında seyreltin; numune başına ~ 3 mL için yeterli tampon yapın.
2. Steril olmayan bir çukuru CSM ile ve diğerini 1X barkodlama perma tamponu ile doldurun. Taze çözülmüş numunelere 1 mL buz gibi soğuk CSM ekleyin, bir pipetle iyice karıştırın ve ilgili önceden etiketlenmiş polipropilen küme tüplerine aktarın.
3. Otomatik bir hücre sa....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ruksolitinib	Santa Cruz Plajı	SC-364729A	Stok Konsantrasyonu: 10 mM; Son Konsantrasyon: 5 μM
R848 Serisi	Canlılık	TLRL-R848-5	Stok Konsantrasyonu: 1 μg/μL; Son Konsantrasyon: 1 μg/mL
LPS-EK	Canlılık	tlrl-eklps	Stok Konsantrasyonu: 1 μg/μL; Son Konsantrasyon: 0.1 μg/mL
Steril PBS	Fransa	17-516F
Lyse/Düzeltme Tamponu	BD biyolojik bilimler	558049	Stok Miktarı: 5X; Son Conc: 1X (ddH2O içinde seyreltin)
BD Fosflow perma/yıkama tamponu I	BD biyolojik bilimler	557885	Stok Konsantrasyonu: 10X; Son Conc: 1:10 (ddH2O içinde seyreltin)
DEV/SINIR	Gibco (Gibco)	21870-076
Sodyum Azid (NaN3)	Sigma-Aldrich	S-8032 Serisi	Stok Konsü:>99.9%; Son Sonuç: 0.0002
Protein Taşıma İnhibitörü (PTI)	eBiosciences (Biyoloji Bilimleri)	00-4980-93	Stok Miktarı: 500X; Son Sonuç: 1X
DNA Ara Bulucu	Akışkan	201192B	Stok Konsantrasyonu: 500 μM; Son Konsantrasyon: 0.1 μM
MaxPar Barkod Perma Tamponu	Akışkan	201057	Stok Konsantrasyonu: 10X; Son Sonuç: 1X
20-plex Pd Barkod Seti	Akışkan	S0014 Serisi	Stok Kons: n/a; Son Sonuç: yok
Kütle Sitometrisi için kullanılan antikorlar
Yüzey işaretleyicileri
CD1c (İngilizce)	Biyoefsane	L161	Kütle: 161
CD3 (İngilizce	Bd	UCHT1	Kütle: 144
CD4 (İngilizce	Biyoefsane	SK3	Kütle: 174
CD7	Bd	M-T701	Kütle: 149
CD8	Biyoefsane	SK1	Kütle: 142
CD11b	Akışkan	ICRF44	Kütle: 209
CD11c (İngilizce)	Bd	B-ly6	Kütle: 152
CD15	Bd	HI98	Kütle: 115
CD14	Biyoefsane	M5E2	Kütle: 154
CD16	eBioscience/Termo	B73.1	Kütle: 165
CD19	Santa Cruz Plajı	SJ25C1	Kütle: 163
CD21	Biyoefsane	Bu32	Kütle: 141
CD27	Bd	L128	Kütle: 155
CD38	Akışkan	HIT2	Kütle: 172
CD45 toplam	Biyoefsane	HI30	Kütle: 89
CD45RA	Biyoefsane	HI100	Kütle: 153
CD56	Miltenyi	REA196	Kütle: 168
CD66	Bd	B1.1/CD66	Kütle: 113
CD86	Akışkan	IT2.2 (BT2.2	Kütle: 150
CD123	Akışkan	6H6	Kütle: 143
CD278/ICOS	Biyoefsane	C398.4A Serisi	Kütle: 156
CD179/PD1	Biyoefsane	EH12.2H7	Kütle: 162
IgD (IgD)	Biyoefsane	IA6-2 (İngilizce	Kütle: 146
ıgm	Biyoefsane	MHM-88	Kütle: 151
CXCR5	Bd	RF8B2	Kütle: 173
HLADR (HLADR)	Biyoefsane	L243	Kütle: 167
Sitokinler
IL-1α	Biyoefsane	364-3B3-14	Kütle: 147
IL-1β	Biyoefsane	H1B-98	Kütle: 169
IL-1RA	Santa Cruz Plajı	AS17	Kütle: 157
IL-6	Biyoefsane	MQ2-13A5	Kütle: 164
IL-8	Bd	E8N1	Kütle: 160
IL-12/IL-23p40	Biyoefsane	C8.6	Kütle: 171
IL-17A Serisi	Biyoefsane	BL168	Kütle: 148
IL23p19	eBioscience/Termo	23dcdp	Kütle: 176
MIP1β	Bd	D21-1351	Kütle: 158
MCP1	Bd	5D3-F7	Kütle: 170
IFNα	Miltenyi	LT27:295	Kütle: 175
IFNγ	Biyoefsane	4S.B3	Kütle: 165
PTEN (Tenis Partisi	Bd	A2B1	Kütle: 159
TNFα	Biyoefsane	MAB11	Kütle: 166
Not: Üretici Fluidigm olarak belirtilmişse, bu antikor Fluidigm'den metal önceden konjuge edilmiş olarak satın alınmıştır. Üretici Fluidigm dışında belirtilmişse, bu antikor, üretici protokolüne göre MaxPar Multi-Metal Etiketleme Kiti (Fluidigm Cat: 201300) kullanılarak kendi kendine konjuge edilmiştir.