$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Parçalanmış/Sabit Kan Hücrelerinin Barkodu
- Parçalanmış / sabitlenmiş hücre örneklerini -80 ° C'lik depodan buz üzerinde yavaşça çözdürün; bu sistem kullanılarak en fazla 20 örnek benzersiz barkodlarla etiketlenebilir ve bir araya getirilebilir. 10X barkodlama perma arabelleğini PBS ile 1:10 oranında seyreltin; numune başına ~ 3 mL için yeterli tampon yapın.
- Steril olmayan bir çukuru CSM ile ve diğerini 1X barkodlama perma tamponu ile doldurun. Taze çözülmüş numunelere 1 mL buz gibi soğuk CSM ekleyin, bir pipetle iyice karıştırın ve ilgili önceden etiketlenmiş polipropilen küme tüplerine aktarın.
- Otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücreleri saymak için 10 μL'lik bir örnek alın. Hücre sayılarını her küme tüpünde örnek başına 1,5–2 x 106 hücre olarak normalleştirin: 2 x 106 hücrenin üzerindeki fazla hücrelerin hacmini çıkarın ve atın.
- Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin. Hücreleri çok kanallı bir pipet ile 1 mL 1X barkodlama perma tamponunda yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin.
- Numunenin barkoduyla eşleşmesi için küme tüplerini bir raf üzerinde barkod anahtarında belirtildiği sırayla hizalayın. Hücre kaybını azaltmak için küme tüplerindeki tüm numunelere pipet uçlarıyla hücre peletine dokunmadan (karıştırma olmadan) çok kanallı pipet ile 800 μL 1X barkodlama perma tamponu ekleyin. Küme tüplerinin bulunduğu rafı bir kenara koyun.
- 20-plex Pd Barkodlama Kiti tüp şeritlerini -20 °C'den çıkarın ve oda sıcaklığında çözdürün. 100 μL 1X barkodlama perma tamponu ekleyin, iyice karıştırın ve 120 μL'lik yeniden askıya alınmış barkod karışımını küme tüplerindeki karşılık gelen hücre örneklerine aktarın.
- Ayrı ayrı barkodlu numuneler arasında çapraz kontaminasyon olmaması için çok kanallı pipetle iyice karıştırın. Barkodların hücreleri etiketlemesine izin vermek için küme tüplerini oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin, ardından 1 mL CSM'de yeniden süspanse edin.
- Santrifüjleyin ve CSM'de tekrar askıya alın.
not: Artık her numune benzersiz bir barkodla etiketlenmiştir ve numuneler havuzlanmaya hazırdır.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Tek bir pipetle ve aynı ucu kullanarak, ~70–80 μL artık hacimdeki tüm hücre peletlerini bir polistiren tüpe aktarın. Pipet ucunu ÇIKARMAYIN; Bu uçla tek pipeti bir kenara koyun.
- Çok kanallı bir pipet ve yeni uçlarla, hücre geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için her orijinal küme tüpüne ~ 100 μL CSM ekleyin. Ucu bir kenara bırakılmış tek pipetle, ~100 μL artık hacimdeki tüm hücre peletlerini aynı polistiren tüpe aktarın.
- Polistiren tüpü (~ 3 mL) tamamlamak için CSM ekleyin. Havuza alınan barkod setinin hücre numarasını sayın ve kaydedin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Barkodlu numuneleri aynı gün boyamaya devam edin.
Not: Barkodlama işleminde ~%20-30 hücre kaybı beklemek normaldir.
2. Barkodlu Parçalanmış/Sabit Kan Hücrelerinin Boyanması ve Kütle Sitometri Cihazında Analiz Hazırlığı
Not: Her 1X boyama antikoru titresi (100 μL boyama reaksiyonu başına 1 μL antikor), genellikle 3-4 x 106 hücreyi boyayabilir. Bu nedenle, tüm barkodlu numuneler tek bir tüpte toplandığında, antikor miktarının artırılması gerekir. 20 barkodlu numune 30 x 106 hücreye tekabül ediyorsa ve her 1X titre 3-4 x 106 hücreyi boyayabiliyorsa, barkodlu numune her numuneyi ayrı ayrı boyamak yerine yalnızca 10X titre gerektirir, bu da 20X miktarda antikor gerektirir (tek tek tüp başına 1X). Antikorun hücre sayısına konsantrasyonu, her bir antikor kokteyli için dikkatlice titre edilmelidir (burada tartışılmamıştır).
- Yüzey boyama ve sitokin indüksiyonu için antikorlar (Malzeme Tablosu) kullanarak hücreleri boyayın.
- Eklenecek miktarı hesaplayarak ve pipetleme hatasını hesaba katarak yüzey boyama kokteylini yapın (yani, her numunede 2 x 106 hücreli 20 barkodlu numune boyanıyorsa, 10X titre boyası gereklidir; nihai hacim hesaplamaları için, 10,5X son boyama solüsyonu yaparak pipetleme hatasını telafi edin).
- Barkodlu hücre peletine 10 kat değerinde yüzey boyama hacmi ekleyin. Hücre kaybını azaltmak için, aynı uçla, yüzey lekelerinin ve hücre peletlerinin hacmini karıştırın ve ölçün.
- Hücrelerin hacmine ve boyama kokteyline bağlı olarak, hücre numunesi sayısı başına 50 μL'lik bir nihai boyama hacmine CSM ekleyin (yani, 20 numunelik bir set çalıştırılıyorsa, 50 μL X 20 = 1 mL). 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Eşit lekelenmeyi teşvik etmek için numuneyi her 15 dakikada bir çalkalayın.
- Yüzey lekesi inkübasyonu sırasında, filtrelenmiş ddH2O ile 1:10 oranında seyrelterek Perma / Yıkama tamponunu (Malzeme Tablosu) hazırlayın. Geçirgenlik için 2 mL ve yıkama için 5 mL hacimler hazırlayın. 4 °C'de veya buz üzerinde tutun.
- Yüzey boyama tüpünü CSM ile doldurun ve 5 dakika boyunca 4 ° C'de 600 x g'da santrifüjleyin. Süpernatantı aspire edin. Barkodlu numuneyi 2 mL 4 °C, 1:10 seyreltme Perma/Yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. Hücrelere tamamen nüfuz etmek için 4 ° C'de 20-30 dakika inkübe edin.
- 5 dakika boyunca 4 ° C'de 600 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin.
- Hücre içi boyama için benzer boyama adımlarını izleyin (yüzey boyamada olduğu gibi). Bununla birlikte, hücrelerin hücre içi boyama boyunca geçirgen bir ortamda kalması için toplam boyama hacmini yapmak için CSM yerine 4 °C, 1:10 seyreltme Perma / Yıkama tamponu kullanın.
- Hücre içi antikor kokteylini yüzeyi lekelenmiş ve geçirgen hücre peletine ekleyin (aşama 2.1.2–2.1.7). Toplam boyama hacmini hücre numunesi sayısı başına 50 μL'ye getirin. 4 ° C'de 60 dakika inkübe edin. Eşit lekelenmeyi sağlamak için numuneyi her 15 dakikada bir çalkalayın.
- Hücre içi boyama sırasında, interkalatör çözeltisini hazırlayın: 900 μL filtrelenmiş PBS + 100 μL filtrelenmiş %16 PFA (nihai konsantrasyon %1.6 PFA) + 0.2 μL 500 uM interkalatör boyası (Malzeme Tablosu).
- Hücre peleti + hücre içi antikor kokteylini soğuk 1:10 Perma/Yıkama tamponu ile doldurun.
- 5 dakika boyunca 4 ° C'de 600 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Boyama tüpünü CSM ile doldurun. Hücre numarasını sayın ve kaydedin. 5 dakika boyunca 4 ° C'de 600 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Hücreleri adım 4.9'dan itibaren 1 mL interkalatör çözeltisinde yeniden süspanse edin. Tam interkalasyon için oda sıcaklığında en az 20 dakika veya gece boyunca 4 °C'de inkübe edin (interkalatör çözeltisindeki numuneler, kütle sitometrisi cihazında çalıştırılmadan önce 1 haftaya kadar 4 °C'de kalabilir).
- Hücreleri kütle sitometrisi cihazı için hazırlayın.
- Tüpü 3 mL filtrelenmiş ddH2O ile doldurun ve 600 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Hücreleri 3 mL filtrelenmiş ddH2O içinde yeniden süspanse edin. Kütle sitometrisi cihazını potansiyel olarak tıkayabilecek herhangi bir kalıntı veya agregayı temizlemek için bu süspansiyonu 100 μm'lik bir filtreden geçirin.
- Filtrasyon sonrası hücre numarasını sayın ve kaydedin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin
- Kalibrasyon boncuğu çözeltisini (Malzeme Tablosu) filtrelenmiş ddH2O içinde 1:10 oranında seyrelterek hazırlayın.
- ~ 1 x 106 hücre / mL.
hücre konsantrasyonu elde etmek için lekeli hücreleri gerekli hacimde 1:10 seyreltilmiş kalibrasyon boncuğu çözeltisinde yeniden süspanse edin
not: 45 μL / dk'da bir CyTOF1 için önerilen optimum 5 x 105 hücre / mL'dir; Helios için 30 μL / dak, 7.5 x 105 hücre / mL.
- Numuneyi kütle sitometri cihazında çalıştırmaya devam edin.