Bağışıklık hücreleri tarafından uygulanan reseptör kuvvetlerini değerlendirmek için DNA tabanlı gerilim problarının kullanılması

Özet

Kaynak: Ma, R. et al., <a href="https://app.jove.com/v/62348">Bağışıklık Hücreleri Tarafından Geçici Piconewton Reseptör Kuvvetlerini Haritalamak için DNA Gerilim Probları. (2021)

Video, polietilen glikol bağlantılı altın nanopartiküller ve DNA firkete gerginlik probları kullanılarak bağışıklık hücreleri tarafından uygulanan reseptör kuvvetlerini değerlendirmek için bir yöntemi göstermektedir. CD8 pozitif T hücresi etkileşimleri, probun açılmasını tetikler, floresan yayarken, kilitleme iplikleri, bağışıklık hücreleri tarafından uygulanan kuvvetleri ölçmek için sinyali sürdürür.

Protokol

1. Oligonükleotid hazırlama

1. Ligand iplikçik deoksiribonükleik asidi (DNA) suda çözün (18.2 MΩ direnç, tüm protokol boyunca kullanılır). Çözeltiyi bir masa üstü santrifüj ile girdap haline getirin ve döndürün. Su hacmini, son konsantrasyon 1 mM olacak şekilde ayarlayın. 260 nm'de absorbansı ölçmek için bir nanodrop spektrofotometresi kullanarak konsantrasyonu doğrulayın ve oligonükleotidin sönme katsayısına dayalı olarak nihai konsantrasyonu belirleyin.
   not: Ligand zinciri, florofor ile konjuge olmak ve biyotinile ligandı sunmak için her terminalde, 5' amin ve 3' biyotin olmak üzere bir modifikasyona sahiptir. Ligand zincirindeki amin grubunun bir florofor ile konjuge edilmesi gerekir. Cy3B boyası, yüksek parlaklığı ve fotostabilitesi nedeniyle bu konjugasyon için kullanılır, ancak genellikle ticari olarak sunulmaz ve şirket içi konjugasyon gerektirir. Buna göre, aşağıdaki bölüm, aminler ve N-hidroksisüksinamid (NHS) ester boyaları arasındaki konjugasyonu açıklamaktadır. Nükleik asit modifikasyonu için tesislere veya kaynaklara erişimi olmayan son kullanıcılar için, modifiye edilmiş nükleik asitler bunun yerine Alexa ve Atto boya ailesi gibi parlak ve ışığa dayanıklı boyalar sunan özel DNA sentezi satıcılarından satın alınabilir.
2. 10x fosfat tamponlu salin (PBS) ve 1 M sodyum bikarbonat (NaHCO3) çözeltileri hazırlayın. 10 μL 1 mM amin ligand iplikçik çözeltisi (10 nmol) 10 μL 10x PBS, 10 μL 1 M NaHCO3 ve 60 μL H₂O ile karıştırın. Kullanmadan hemen önce 50 μg Cy3B N-hidroksisüksinimidi (NHS esteri) 10 μL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözün ve toplam 100 μL reaksiyon hacmi için karışıma ekleyin. Cy3B NHS esteri ekleyin son. Gece boyunca oda sıcaklığında 1 saat veya 4 °C reaksiyona girmesine izin verin.
3. Amin kilitleme zincirini Atto647N NHS esteri ile konjuge ederek Atto647N kilitleme zincirini hazırlayın. 10x PBS ve 1 M NaHCO₃ çözeltisi hazırlayın. 10 μL 1 mM amin kilitleme ipliği çözeltisinin (10 nmol) 10 μL 10x PBS, 10 μL 1 M NaHCO3 ve 60 μL H₂O ile karıştırın. Kullanmadan hemen önce 50 μg Atto647N NHS esterini 10 μL DMSO içinde çözün ve toplam 100 μL reaksiyon hacmi için karışıma ekleyin. En son Atto647N NHS esterini ekleyin. Gece boyunca oda sıcaklığında 1 saat veya 4 °C reaksiyona girmesine izin verin.
4. Reaksiyonlardan sonra, P2 tuz giderme jeli filtrasyonu ile yan ürünleri, fazla boyayı ve tuzları uzaklaştırın. Reaksiyon karışımını H₂O ile sonraki Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) saflaştırma adımı için uygun olan toplam 300 μL hacme seyreltin. Santrifüjlü bir cihaza 650 μL hidratlı P2 jeli ekleyin ve 1 dakika boyunca 18.000 x g'da döndürün. Cihazın altındaki sıvıyı çıkarın, reaksiyon karışımını P2 jel içeren kolona ekleyin, 18.000 x g'da 1 dakika döndürün ve reaksiyon karışımını cihazın altında toplayın.
   not: P2 jel, H₂O ile kullanılmadan en az 4 saat önce nemlendirilmelidir.
5. Tuzdan arındırılmış reaksiyon karışımını, oligonükleotid saflaştırması için tasarlanmış bir C18 sütunu kullanarak, H₂O ve B: asetonitril (ACN) içinde çözücü A: 0.1 M trietilamonyum asetat (TEAA) ile 50 dakika boyunca 50 dakika boyunca %10-100 B 0.5 mL/dk akış hızında saflaştırın. Tuzdan arındırılmış reaksiyon karışımını, saflaştırma için 500 μL'lik bir enjeksiyon döngüsü ile ters fazlı HPLC'ye enjekte edin. Deoksiribonükleik asit, DNA (260 nm) ve florofor için bir absorbans zirvesi (Cy3B için 560 nm ve Atto647N için 647 nm) için bir absorbans zirvesine sahip ürünü toplayın ve bunları gece boyunca bir vakumlu santrifüj yoğunlaştırıcıda kurutun (bkz. Şekil 1A).
6. Kurutulmuş oligo-boya ürününü 100 μL suda sulandırın. Nanodrop spektrofotometresi ile Cy3B ligand ipliğinin ve Atto647N kilitleme ipliğinin konsantrasyonunu belirleyin. Boya etiketleme oranının 1:1'e yakın olduğundan emin olun. Oligonükleotid konsantrasyonunu belirlerken gerekirse boyanın 260 nm emilimini düzeltin.
7. Saflaştırılmış ürünü, matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon-uçuş süresi kütle spektrometresi (MALDI-TOF-MS) ile doğrulayın substrat olarak 3-Hidroksipropiyonaldehit (3-HPA) kullanarak% 50 ACN / H₂O% 0.1 triflorasetik asit (TFA) ve 5 mg / mL amonyum sitrat MALDI-TOF-MS numune hazırlama için 1-5 μM'de 0.5 μL ürün kullanarak. Örnek bir kütle spektrumu Şekil 1B'de bulunabilir.
8. Saç tokası telini ve söndürücü ankraj telini suda çözün ve stok çözeltilerinin konsantrasyonunun 50 ila 100 μM.
   arasında olduğundan emin olun not: Saç tokası ipliği değiştirilmemiştir ve bir satıcıdan doğrudan özel olarak sentezlenebilir. Ankraj ipliği, bir tiyol ankraj grubuna ve bir söndürücü BHQ2'ye sahiptir ve bir satıcıdan doğrudan özel olarak sentezlenebilir.
9. Tüm oligonükleotidleri aliquot. Kısa süreli kullanım ve saklama için bu oligonükleotidleri 4 °C'de saklayın. Uzun süreli saklama için dondurun ve -20 °C'de saklayın. Bu noktada, tüm oligonükleotidler DNA gerilim probu düzeneği için hazırdır.
   not: Tekrarlanan donma-çözülme döngüleri oligonükleotidler için sorunlu değildir.

2. Yüzey hazırlığı

NOT: DNA firkete gerginlik probu substratlarının hazırlanması iki gün sürer. DNA firkete gerginlik probu, cam lameller üzerinde işlevsel hale getirilecektir.

1. 1. Gün
   1. 25 mm'lik lamelleri 50 mL'lik bir beherde bir politetrafloroetilen rafına yerleştirin. Her raf 8 adede kadar lamel tutabilir. Lamelleri üç kez suya batırarak durulayın.
   2. Raf ve lamellerin bulunduğu behere su ile karıştırılmış 40 mL 1: 1 oranlı (v: v) etanol çözeltisi ekleyin ve beheri bir parafin filmi kullanarak kapatın.
   3. Lamelleri temizlemek için beheri ultrasonik bir temizleyicide (çalışma frekansı 35 KHz) 15 dakika boyunca sonikleştirin. Sonikasyondan sonra, sıvıyı atın ve kalan organik çözücüyü çıkarmak için beheri raf ve içindeki lameller ile en az 6 kez suyla durulayın.
   4. Sülfürik asit ve hidrojen peroksiti 3:1 oranında karıştırarak taze Piranha çözeltisi hazırlayın. 40 mL Piranha çözeltisi yapmak için, önce 50 mL'lik temiz bir behere 30 mL sülfürik asit ekleyin ve ardından yavaşça 10 mL hidrojen peroksit,_H2O2ekleyin. Piranha çözeltisi, H₂O₂ ilavesi üzerine hızla ısınır ve köpürür. Bir cam pipetin ucunu kullanarak piranayı yavaşça karıştırın.
   5. Ardından, lamelleri tutan rafı, aşındırma için hafifçe karıştırılmış Piranha çözeltisi içeren behere aktarın (Şekil 2A). Piranha çözeltisinin hidroksilatlanmasına izin verin ve lamelleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca temizleyin. Piranha aşındırma işleminden sonra, rafı çelik veya politetrafloroetilen cımbız kullanarak suyla temiz 50 mL'lik bir behere aktarın ve en az 6 kez suyla tekrar durulayın.
      Dikkat: Büyük miktarlarda organik maddeler Piranha çözeltisi ile kuvvetli bir şekilde reaksiyona girebilir ve patlamaya neden olabilir. Dikkatli olun ve her zaman çeker ocakta Piranha solüsyonu ile çalışın. Laboratuvar önlüğü, eldiven ve koruyucu gözlük taktığınızdan emin olun. Taze Piranha çözeltisini asla kapalı bir kapta saklamayın.
      not: Hidrojen peroksit / sülfürik asit oranı 1: 2 (v : v) altında tutulmalı ve asla 1: 1'i geçmemelidir. Rafı lamellerle Piranha çözeltisine batırırken, bunları yavaş ve dikkatli bir şekilde çözeltiye yerleştirin. Çözeltiyi aşındırmadan hemen sonra atmayın, çünkü hala aktif ve sıcaktır. Asit atık kabına dökmeden önce bir gece beherde bırakın.
   6. Suyu çıkarmak için lamelleri tutan rafı 40 mL etanol içeren 50 mL'lik bir behere daldırın. Etanolü atın ve suyun çıkarıldığından emin olmak için 3 kez tekrarlayın.
   7. Daha sonra rafı% 3 aminopropil trietoksi silan (APTES) (v / v) içinde 40 mL etanol içine daldırın ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca lameller üzerindeki -OH ile reaksiyona sağlayabilirsiniz (Şekil 2B).
      not: Etanol aseton ile değiştirilebilir.
   8. Yüzeyleri 40 mL etanole batırarak 6 kez durulayın, ardından 80 °C'de 20 dakika fırında kurutun. Soğuduktan sonra, kurutulmuş amin modifiyeli lamelleri ileride kullanmak üzere (6 aya kadar) -20 °C'de saklayın.
   9. 10 cm çapındaki plastik petri kaplarının alt iç tarafını parafin film ile kapatın. Parafin film, lamellerin Petri kabının içinde kaymasını önler ve lamellerin bir sonraki işlevsel hale getirme adımları için çözümün korunmasına yardımcı olur. Soğutulmuş amin modifiyeli lamelleri Petri kaplarına yerleştirin. İşlevselleştirilecek taraf yukarı bakmalıdır.
   10. Lamellerdeki amin gruplarını modifiye etmek için, her bir lamel üzerine 0,1 M NaHCO3 içinde 300 μL %0,5 w/v lipoik asit poli (etilen glikol) (PEG) NHS (LA-PEG-SC) ve %2,5 w / v mPEG NHS (mPEG-SC) ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin (Şekil 2C). Her 25 mm'lik lamel için 1,5 mg LA-PEG-SC ve 7,5 mg mPEG-SC ağırlığındadır. NHS reaktiflerini, oda sıcaklığında sulu bir çözelti içinde kısa bir yarı ömre (~ 10 dakika) sahip oldukları için yüzeylere eklemeden hemen önce çözün. Reaksiyondan sonra yüzeyleri 3 kez su ile durulayın.
       not: NHS reaksiyonu gece boyunca 4 °C'de gerçekleştirilebilir. NHS reaktifleri, 4 °C'de hidrolizden önce daha uzun bir yarı ömre sahiptir, bu da yaklaşık 4-6 saattir. Bu, üç günlük bir yüzey hazırlama prosedürü ile sonuçlanacaktır.
   11. 100 μL 0.1 M sodyum bikarbonat, 1 mg / mL sülfo-NHS asetat içeren_NaHCO3'ü bir dizi "sandviç" lamellere ekleyin (aralarında reaksiyon tamponu ile birbirine bakan iki lamel). Pasivasyonun en az 30 dakika sürmesine izin verin. Reaktifi kurtarmak için bu adım 50 μL 1 mg/mL sülfo-NHS asetat ile yapılabilir. Pasivasyondan sonra üç kez su ile durulayın.
   12. Her lamele 0.5 mL altın nanopartikül (AuNP, 8.8 nm, tanik asit, 0.05 mg / mL) ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin (Şekil 2D). Reaktifi kurtarmak için, bu adım iki lamel sandviçlenerek de yapılabilir. Altın nanopartiküllerin toplanmasını önlemek için önceki adımlardan sistemde tuz bulunmadığından emin olun. Bu adımdan sonra lamelleri kurumaya bırakmayın.
   13. Bu arada, bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüpünde 300 nM'de 1 M sodyum klorürde (NaCl) 1.1: 1: 1 oranında DNA gerilim problarını oluşturan 4.7 pN saç tokası, Cy3B ligand ipliği ve BHQ2 çapa zincirini önceden hibritleyin. Çözeltiyi 5 dakika boyunca 95 ° C'ye kadar ısıtarak telleri tavlayın, ardından bir termal döngüleyicide sıcaklığı 30 dakika boyunca 20 ° C'ye düşürerek yavaş yavaş soğutun.
   14. Altın nanopartiküller ile 30 dakikalık inkübasyondan sonra lamelleri üç kez suyla durulayın. BHQ2 çapa ipliği ile Cy3B ligand ipliği arasındaki oranı 10:1 yapmak için tavlanmış DNA çözeltisine ek bir BHQ2 çapa ipliği (100 μM stoktan) ekleyin. Bu noktada, DNA çözeltisi 300 nM gerilim probu yapısı ve 2.7 μM BHQ2 iplikçik içermelidir. "Sandviçi" yapmak için iki lamel başına 100 μL ekleyin (Şekil 2E).
   15. Islak bir laboratuvar mendil topunu Petri kabına (lamellerden uzağa) dikkatlice yerleştirin ve çözeltinin kurumasını önlemek için kabı parafin filmle kapatın. Çanağı folyo ile örtün ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
2. 2. Gün
   1. Lamellerdeki fazla probları 1x PBS ile yıkayın. Epifloresan mikroskop altında DNA gerilim probu yüzey kalitesini kontrol edin.
   2. 1x PBS'de 40 μg / mL streptavidin hazırlayın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca lameller üzerinde inkübe edin (Şekil 2F). Genellikle, 25 mm'lik bir lamel için 100 μL yeterlidir. Fazla streptavidin miktarını yıkamak için inkübasyondan sonra 3 kez PBS ile durulayın.
   3. 1x PBS'de 40 μg / mL biyotinile antikor / ligand hazırlayın. Sandviç başına 50-100 μL ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin (Şekil 2G). Fazla miktarda biyotinile antikor / ligandı yıkamak için inkübasyondan sonra üç kez PBS ile durulayın.
   4. Temiz görüntüleme odalarını yüzeylerle dikkatli bir şekilde birleştirin. Hazneleri sıkarken yüzeyler kolayca çatlayabilir. Görüntüleme odalarına 0.5-1 mL Hank'in dengeli tuz solüsyonunu (HBSS) ekleyin ve hücrelerle görüntülemeye hazır tutun (Şekil 2H).

3. Hücre reseptör kuvvetlerinin görüntülenmesi

1. HBSS'de ilgilenilen bağışıklık hücrelerini 1-2 x 10⁶ hücre / mL.
   hazırlayın not: Bu yazıda OT-1 CD8+ naif hücreler örnek olarak kullanılmıştır. Üreticinin talimatlarına uygun olarak manyetik olarak etkinleştirilen hücre sıralama (MACS) ayırıcılı MACS fare CD8⁺ T hücre izolasyon kitini kullanarak FEDA edilen farelerin dalaklarından OT-1 ^CD8+ saf T hücrelerini saflaştırın. Manyetik olarak tükenen antikor kokteylinin bağlı olduğu CD8 + T olmayan hücreleri çıkararak CD8 ⁺ T hücrelerini izole edin ve zenginleştirin. HBSS'de saflaştırılmış OT-1 CD8 + saf T hücrelerini 2 x 10⁶ hücre / mL'de yeniden süspanse edin ve kullanmadan önce buz üzerinde tutun.
2. Ligandları veya kaplama hücrelerini eklemeden önce kalite kontrol için bir floresan mikroskobu (100x objektif) altında DNA firkete gerginlik probu yüzeyinin kalitesini kontrol edin. Bir DNA firkete gerginlik probu yüzeyinin Cy3B kanalındaki ortalama arka plan yoğunluğunu en az 5 farklı konumdan ve 3 kopyadan görüntüleyin ve ölçün. Bu değerin yüzey kalitesi ve prob yoğunluğunun güvenilir bir belirteci olarak kullanılabilmesi için görüntüleme elde etme koşullarını tutarlı tutun (Şekil 3C).
   not: Literatüre göre, yüzey hazırlığının ilk birkaç kez altın nanopartikül başına DNA iplikçik sayısını ve μm² başına altın nanopartikül sayısını ölçün, bu da yüzey kalitesinin başka bir güvenilir belirteci olarak kullanılabilir.
3. Her bir DNA gerginlik probu işlevselleştirilmiş lamel üzerine ~ 4 x 10⁴ hücreli plaka ve oda sıcaklığında ~ 15 dakika boyunca takılmalarına ve yayılmalarına izin verin.
4. Hücreler DNA firkete gerginlik probları üzerine kaplanıp yayılmaya başladığında, Cy3B kanalında üretilen floresan sinyallerini 100x objektif ile görüntüleyin (Şekil 2I).
5. Hücreler, Cy3B kanalındaki DNA firkete gerginlik probu yüzeyinde gerçek zamanlı gerilim sinyali üretmeye başladıktan sonra, hem Cy3B hem de Atto647N kanallarında görüntüler elde edin (Toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu, epifloresanstan daha iyi sinyal-gürültü oranı sağlar). Daha sonra, mekanik olarak seçici hibridizasyon için Atto647N iplikçikini 200 nM'lik bir son konsantrasyonda görüntüleme odalarına ekleyin.
6. 10 dakikalık inkübasyondan sonra, floresan Atto647N kilitleme ipliğini içeren tamponu hızlı ve nazikçe çıkarın ve yerine taze Hank'in dengeli tuzları koyun. Hem Cy3B hem de Atto647N kanallarında tekrar görüntü alın ve Fiji yazılımı ile Pearson korelasyon katsayısını belirleyin.
7. Araştırmanın ilgilendiği zaman noktasında, gerginlik sinyalini depolamak için görüntüleme odasındaki hücrelere floresan olmayan bir kilitleme ipliği yerleştirin. Kilitleme ipliği stoğunu (100 μM) hazırlayın ve hücrelere 1 μM'lik bir son konsantrasyonda ekleyin. Karıştırmak için hafifçe pipetleyin. Kilitleme süresi değişebilir ancak önerilen süre 10 dakikadır.
8. Gerektiğinde hem kalitatif gerilim haritalaması hem de kantitatif analiz için epifloresanda hızlandırılmış filmler veya uç nokta görüntüleri elde edin (Şekil 2J ve Şekil 4).
   not: Birden fazla zaman noktasında gerginlik ölçümü isteniyorsa, bir kilit açma ipi ekleyerek depolanan gerginlik sinyallerinin silinmesini başlatın. Aşırı durulamayı önlemek için, kilit açma ipliğinin 2 μM'de daha yüksek bir nihai konsantrasyonu, depolanan sinyalleri silen kilitleme ipliği ile 3 dakika boyunca ayak parmağı aracılı bir iplik yer değiştirme reaksiyonu başlatmak için kullanılır (Şekil 2J). Fazla oligonükleotidleri HBSS ile nazikçe durulayın. DNA firkete gerginlik probu yüzeyi ve hücreler başka bir gerilim depolama ve haritalama turu için hazırdır. Çalışmada yalnızca bir zaman noktası ilgi çekiyorsa, gerilim sinyallerinin kilidini açmak gerekli değildir.

Sonuçlar

Şekil 1: Oligonükleotid hazırlama örnekleri.(A) Cy3B ligand ipliği saflaştırmasının HPLC kromatogramı; (B) Ürünün MALDI-TOF-MS spektrumları; (C) Hesaplanan kütle tablosu ve başlangıç malzemesinin ve etiketli oligonükleotidin bulunan m/z tepe noktaları.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
3-hidroksipikolinik asit (3-HPA)	Sigma	56197	Maldi-TOF-MS matrisi
mPEG-SC	Biyokimya	MF001023-2K	Yüzey hazırlığı
(3-Aminopropil) trietoksisilan	Akros Antik Kenti	AC430941000	Yüzey hazırlığı
10x Kırmızı kan hücresi lizis tamponu	Biyoefsane	00-4333-57	arabellek
8.8 nm altın nanopartiküller, tanik asit	Nanokompozit Altı	ÖZELLEŞTİRİLM	Yüzey hazırlığı
Atto647N NHS esteri	Sigma	18373-1MG-F	Florofor, oligo preparat
Mikroskopi için Attofluor Hücre Odası	Thermo Fisher Bilimsel	A7816	Görüntüleme
BD Şırıngalar sadece Luer-Lok ile	BD biyobilim	309657	Hücre
Biyotinile anti-fare CD3e	ebiyobilim	13-0031-82	Antikor/ligand
Biyotinile pMHC ovalbümin (SIINFEKL)	Emory Üniversitesi'ndeki NIH Tetramer Çekirdek Tesisi	Na	Antikor/ligand
Sığır serum albümini	Sigma	735078001	Spesifik olmayan etkileşimleri engelleme
Hücre süzgeçleri	Biyoloji	15-1100	Hücre
Lamel Mini Raf, teflon	Thermo Fisher Bilimsel	C14784	Yüzey hazırlığı
Cy3B NHS esteri	GE Sağlık	PA63101	Florofor, oligo preparat
Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS)	Corning	21-031-CM	arabellek
etanol	Sigma	459836	Yüzey hazırlığı
Hank'in dengeli tuzları (HBSS)	Sigma	H8264	arabellek
Hidrojen peroksit	Sigma	H1009	Yüzey hazırlığı
LA-PEG-SC	Biyokimya	HE039023-3.4K	Yüzey hazırlığı
Midi MACS (LS) başlangıç kiti	Miltenyi Biyotec	130-042-301	Hücre
Fare CD8+ T hücre izolasyon kiti	Miltenyi Biyotec	130-104-075	Hücre
Nanosep MF santrifüj cihazları	Pall laboratuvarı	ODM02C35	Oligo hazırlığı
2 numaralı yuvarlak cam lameller	VWR (VWR)	48382-085	Yüzey hazırlığı
NTA-SAM (Ulusal Futbol Örgütü)	Dojindo Moleküler Teknolojiler	N475-10	Yüzey hazırlığı
P2 jel	Biyo-rad	1504118	Oligo hazırlığı
Sülfürik asit	EMD Millipore Şirketi	SX1244-6	Yüzey hazırlığı
Sülfo-NHS asetat	Thermo Fisher Bilimsel	26777	Yüzey hazırlığı
ekipman
Agilent AdvanceBio Oligonükleotid C18 kolonu, 4,6 x 150 mm, 2,7 μm	653950-702		Oligonükleotid hazırlama
Barnstead Nanopure su arıtma sistemi	Termo Balıkçı		Su
CFI Apo 100× NA 1.49 hedefi	Nikon		Mikroskopi
Cy5 küpü	Chroma		Mikroskopi
Elektron çarpımını geliştiren yük birleştirilmiş cihaz (EMCCD)	Fotometri		Mikroskopi
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi	Agilent 1100 Nişanı		Oligonükleotid hazırlama
Yoğun ışık epifloresan kaynağı	Nikon		Mikroskopi
Matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon uçuş süresi kütle spektrometresi (MALDI-TOF-MS)	Yolcu Caddesi		Oligonükleotid hazırlama
Nanodrop 2000 UV-Vis Spektrofotometresi	Termo Balıkçı		Oligonükleotid hazırlama
Nikon Eclipse Ti ters mikroskop	Nikon		Mikroskopi
Nikon Mükemmel Odaklama Sistemi	Nikon		Mikroskopi
NIS Elements yazılımı	Nikon		Mikroskopi
Dört bantlı TIRF 405/488/561/647 küp	Chroma		Mikroskopi
RICM küpü	Chroma		Mikroskopi
488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW) ve 640 nm ile TIRF başlatıcı	yapışık		Mikroskopi
TRITC küpü	Chroma		Mikroskopi
Oligo adı	5' değişiklik / 3' değişiklik	Sıra (5' ila 3')	kullanmak
15mer amin kilitleme ipliği	5' Değişiklik: Değişiklik Yok 3' değişiklik: /3AMMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	Gerçek zamanlı gerginlik sinyalini kilitleme
15mer Atto647N kilitleme teli	5' değişiklik: Atto647N 3' değişiklik: /3AMMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	Gerçek zamanlı gerginlik sinyalini kilitleme
15mer floresan olmayan kilitleme ipliği	5' Değişiklik: Değişiklik Yok 3' Değişiklik: Değişiklik yok	A AAA AAC ATT TAT AC	Kantitatif analiz için gerçek zamanlı gerginlik sinyalini kilitleme
4.7 pN saç tokası ipliği	5' Değişiklik: Değişiklik Yok 3' Değişiklik: Değişiklik yok	GTGAAATACCGCAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC (Türkçe)	Saç tokası probu
Amin ligand ipliği	5' değişiklik: /5AmMC6/ 3' değişiklik: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	Saç tokası probu
BHQ2 çapa ipliği	5' değişiklik: /5ThiolMC6-D/ 3' değişiklik: /3BHQ_2/	TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT	Saç tokası probu
Cy3B ligand ipliği	5' değişiklik: Cy3B 3' değişiklik: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	Saç tokası probu
Kilit açma ipliği	5' Değişiklik: Değişiklik Yok 3' Değişiklik: Değişiklik yok	ETIKET: GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C	Birikmiş gerginlik sinyalinin kilidinin açılması