İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. A. fumigatus Kültür ve Koşulları
- Glikoz minimal agar ortamını açıklandığı gibi hazırlayın.
- 1 M sodyum hidroksit (NaOH) kullanarak ortamı pH 6.5'e ayarlayın ve 120 °C'de 20 dakika boyunca otoklav yapın.
- 65 °C'ye kadar soğumaya bırakın.
- Steril bir akış başlığında çalışarak, 30 mL soğutulmuş ortamı bir T75 şişesine dökün ve bir agar eğimi oluşturmak için şişenin boynu 25 mL'lik bir pipet üzerinde durarak soğumaya bırakın.
- dsRed Af293-Aspergillus fumigatus suşunu agar üzerinde çizgi haline getirin ve 37 °C + %5 karbondioksitte (CO2) 7 gün inkübe edin. İki şişe, 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ön biyotinilasyonunda yaklaşık 109 conidia verecektir.
2. A. fumigatus Etiketleme ve Hazırlama
NOT: Bu testi ilk kez gerçekleştirirken, ebeveyn Af293-A. fumigatus suşunu hazırlayın. Mikrosantrifüj tüplerinde her iki suşun örneklerini alın ve aşağıda açıklandığı gibi her bir suştan yalnızca birini etiketleyin. Bu, kurulumu ve ekipmanı test etmek için renksiz conidia ve dsRed veya Alexa Fluor 633 (AF633) gibi tek renkli conidia kontrolüne sahip olmasına izin verecektir.
- Kültürü 30 mL PBS +% 0.05 Tween-80 ile daldırarak A. fumigatus conidia'yı hasat edin. Elde edilen süspansiyonu, hif parçalarını çıkarmak için 40 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir tüpe süzün.
- 805 x g'da 10 dakika santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve 20 mL steril PBS'de bir kez yıkayın. Yıkama aşaması sırasında aynı suşun iki plakasından havuz conidia.
- Yıkama adımını takiben, peleti 5 mL PBS'de yeniden süspanse edin ve 1 mL konidiyal süspansiyon alikotunu mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Canlı hücre görüntüleme için genellikle her suşun 1 mL süspansiyonu yeterlidir. Kalan alikotları folyoya sarın ve 4 °C'de saklayın.
- Konidiyal süspansiyon alikotlarını oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 9.300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın. Konidiyal peleti 1 mL 0.05 M sodyum bikarbonat (NaHCO3) pH 8.3'te yeniden süspanse edin.
- 500 μL DMSO'da 25 mg biotini sulandırarak 10 mg biotin / 200 μL dimetil sülfoksit (DMSO) stok çözeltisi hazırlayın. Mikrosantrifüj tüpüne 10 μL biotin/DMSO stok çözeltisi ekleyin, alüminyum folyo ile kaplayın ve 4 ° C'de bir külbütör üzerinde 2 saat inkübe edin.
- Biotin/DMSO stok çözeltisinin geri kalanını ayırın ve sonraki deneylerde kullanmak üzere -20 ° C'de dondurun.
- 9.300 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın. Serbest yüzen biyotini devre dışı bırakmak için konidiyal peleti 1 mL 100 mM Tris (hidroksimetil) aminometan-hidroklorür (Tris-HCl) pH 8.0'da 1 saat boyunca yeniden süspanse edin.
- 9.300 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın. Peleti 1 mL steril PBS ile iki kez yıkayın ve peleti 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin.
- 2 mg / mL'lik bir stok çözeltisi yapmak için 1 mg Streptavidin-AF633'ü 0.5 mL PBS'de çözün. 1 mL konidiyal süspansiyon başına 10 μL 2 mg / mL streptavidin-AF633 ekleyin ve alüminyum folyo ile kaplı bir külbütör üzerinde oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin. Kalan Streptavidin-AF633, sonraki deneylerde kullanılmak üzere alikotlar halinde dondurulabilir.
- 9.300 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın. Konidiyal peleti 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin ve 1: 1.000 seyreltmede (1: 100 ve sonra 1: 10) bir hemositometre kullanarak conidia'yı sayın. CO2'den bağımsız ortamla konidiyal konsantrasyonu 3,6 x 106 / mL'ye ayarlayın, folyoya sarın ve 4 ° C'de saklayın
not: Conidia artık AF633 ile etiketlenmiştir ve FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia olarak anılacaktır.
- İsteğe bağlı: Şişmiş conidia ile stimülasyon gerekiyorsa, conidia saydıktan sonra (adım 2.9), conidia'yı maya nitrojen bazı (YNB) ortamında 7.2 x 106 / mL'ye seyreltin ve otoklavlanmış 50 mL Erlenmeyer şişesinde 4.5 mL YNB ortamına 500 μL konidiyal süspansiyon ekleyin. Şişeyi örtün ve 6 saat boyunca çalkalanan bir inkübatöre (37 °C'de 200 rpm) yerleştirin.
- Ortamı 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 805 x g'da santrifüjleyin ve PBS'de bir kez yıkayın. Tekrar santrifüjleyin ve peleti 1 mL CO2 bağımsız ortamda yeniden süspanse edin, 3.6 x 106 conidia / mL.
NOT: Conidia sıklıkla şiştikten sonra topaklanır ve doğru sayımı zorlaştırır, kullanılan dinlenme conidia'nın sayılan sayıları ile hesaplanması tavsiye edilir.
>3. İnsan Nötrofillerinin ve Monositlerinin İzolasyonu
- Sağlıklı gönüllülerden 20 mL venöz kanı, etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren iki adet 10 mL kan tüpüne alın. Her donör için ayrı ayrı, 50 mL'lik bir tüpe 20 mL kan dökün ve 15 mL PBS ile seyreltin.
- Kanı bir şırınga ve demir iğne ile 15 mL lenfosit izolasyon solüsyonu (yoğunluk 1.077 g / mL) ile doldurun. İğneyi tüpün altına yerleştirin ve lenfosit izolasyon solüsyonunu nazikçe dışarı doğru itin. Frensiz ve düşük ivmelenme ile 20 dakika boyunca 630 x g'da santrifüjleyin.
- Buz üzerinde soğutulmuş PBS'yi hazırlayın.
not: Monositler (3.4) ve nötrofiller (3.5) oluşturmak için 3.4 ve 3.5 adımları aynı anda takip edilmelidir.
- Bir hamur eti kullanarak periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) tabakasını hasat edin. Bu, sarı serum (üst) ile şeffaf lenfosit izolasyon solüsyonu (alt) tabakası arasındaki merkezdeki tabakadır ve 50 mL'lik taze bir tüpe aktarılır.
- Tüpü PBMC ile 50 mL'ye kadar soğuk PBS ile doldurun ve 10 dakika boyunca 582 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve soğuk PBS ile iki kez yıkayın ve başlangıçta kullanılan 20 mL donör kanı başına 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin.
- 160 μL PBS ve 20 μL tripan mavisine 20 μL hücre süspansiyonu ekleyerek sayım için 1:10 seyreltme yapın. Bir hemositometre ile hücreleri sayın.
- 500 mL Hank'in dengeli tuz çözeltisine (HBSS) 26 mL ısıyla inaktive edilmiş fetal buzağı serumu (FCS) ve 2.1 mL 0.5 M EDTA ekleyerek bir tampon çözeltisi hazırlayın. Hücreleri 515 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve 1 x 107 hücre başına 40 μL tampon çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.
- Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 1 x 107 hücre başına 10 μL CD14 mikro boncuk ekleyin, iyice karıştırın ve tüpleri her 5 dakikada bir karıştırdığınızdan emin olarak 4 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
- 1 x 107 hücre başına 1 mL tampon çözeltisi ekleyerek hücreleri yıkayın ve 10 dakika boyunca 515 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı tamamen aspire edin ve 500 μL tampon çözeltisinde 1 x 108 hücreye kadar yeniden süspanse edin.
- Üreticinin talimatlarına göre manyetik bir ayırıcı üzerine numune başına 1 sütun yerleştirin. İlk olarak, sütunu bir kez 500 μL tampon çözeltisi ile yıkayın.
- 500 μL hücre süspansiyonunu kolondan pipetleyin, kolonun kurumasını bekleyin ve ardından bunu tampon solüsyonu ile üç kez tekrarlayarak yıkayın.
- Kolonun altına 15 mL'lik yeni bir tüp yerleştirin ve kolonu manyetik ayırıcıdan çıkarın. Daha sonra hücreleri kolondan 1 mL tampon çözeltisi ile tüpe yıkayın.
- 4 mL tampon çözeltisi ekleyin ve 10 dakika boyunca 515 x g'da santrifüjleyin ve ardından 1 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamında yeniden süspanse edin.
- 160 μL PBS ve 20 μL tripan mavisine 20 μL hücre süspansiyonu ekleyerek sayım için 1:10 seyreltme yapın. Hücreleri bir hemositometre ile sayın.
- Hücre konsantrasyonunu RPMI ile 6 x 105 / mL'ye ayarlayın ve 35 mm'lik cam bazlı bir görüntüleme kabında 200 μL tohumlayın. Gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe edin.
- Ertesi gün, görüntülemeden önce, RPMI'yi çıkarın ve 200 μL CO2'den bağımsız ortam ekleyin.
not: Bu monositler, görüntülemeden önce çeşitli makrofaj alt kümelerine de ayırt edilebilir. Eğer bu araştırılması gereken bir teknikse, mükemmel bir başlangıç noktası Ohradanova-Repic ve arkadaşlarının yakın tarihli bir makalesidir.
- PBMC tabakasını hasat ettikten sonra, serumun tamamını ve lenfosit izolasyon solüsyonunun çoğunu çıkarın, ancak nötrofillerin çoğunu içereceğinden, kırmızı peletin üstündeki küçük beyaz bandı çıkarmamaya dikkat edin.
- 1 L steril suya 83 g amonyum klorür (NH4Cl) ve 10 g potasyum bikarbonat (KHCO3) ekleyerek 10x hipotonik lizis tampon stoğu hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
- Bu stoğu 10x steril suyla seyreltin ve tüplere ekleyin. Daha sonra dikkatlice 3 kez ters çevirin ve 15 dakika buzda inkübe edin.
- 394 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve buz içinde 10 dakika boyunca hipotonik lizis tamponunda yeniden süspanse edin.
- 394 x g'da santrifüjleyin ve soğuk PBS ile iki kez yıkayın. Donör başına 1 mL CO2'den bağımsız ortamda yeniden süspanse edin.
- 160 μL PBS ve 20 μL tripan mavisine 20 μL hücre süspansiyonu ekleyerek sayım için 1:10 seyreltme yapın. Hücreleri bir hemositometre ile sayın.
- Mikroskopi için, 35 mm'lik cam bazlı bir görüntüleme kabına 200 μL aynı hücre süspansiyonu ekleyin.
NOT: Nötrofil görüntüleme veya akış sitometrisi, uyarılmadan bırakılırsa apoptoza uğrama eğilimleri nedeniyle hemen başlatılmalıdır. Bu mümkün değilse, nötrofiller buz üzerinde tutulmalı ve mümkün olan en kısa sürede (aynı gün içinde) kullanılmalıdır.
4. Canlı Hücre Video Mikroskobu
NOT: Mikroskop seçimi, yerel olarak neyin mevcut olduğuna bağlı olacaktır, ancak mikroskop kurulumunun ters çevrilmiş bir aşama, 37 °C'ye ısıtılmış bir çevre odası ve dsRed (532/561 nm) ve AF633 (633 nm) için uygun uyarma/emisyon filtreleri içermesi gerekecektir. FLARE conidia, dsRed için 532/561 nm lazer yerine 488 nm lazerle çalışmaz. Bu deneyi ilk kez gerçekleştirirken, dsRed ve AF633 kanalları arasında arka plan floresansı ve taşma geçişini test etmek için renksiz ve tek renkli kontrol conidia'sını kullanın.
- Deneyden önce mikroskop ısıtıcısını açın ve çevresel kontrol odasının 37 °C'ye ısınması için yeterli zaman tanıyın. Oda sıcaklığının stabilize olması için geçen süre, farklı mikroskop kurulumları için değişecektir.
- Mikroskobu ve bilgisayarı açın ve görüntüleme yazılımını yükleyin. Görüntüleme kabını mikroskop tablasına monte edin ve insan nötrofillerini veya monositlerini bulmak için odağı ayarlayın.
- dsRed ve AF633 için, çekim ayarlarında lazer gücünü %10'a ve pozlama süresini 1 saniyeye ayarlayın.
- Görüntüleme slaytını çıkarın ve uygun kuyucuklara 100 μL 3 x 106 / mL FLARE konidiyal süspansiyon ekleyin (toplam hacim 300 μL / kuyu). FLARE conidia'nın yemeğe eklendiği zamanı kaydedin.
- Slaytı sahne alanına geri getirin ve conidia'yı net bir şekilde görmek ancak görüntüyü aşırı pozlamamak için dsRed ve AF633 için kamera hassasiyetini ayarlayın. Çok noktalı alım gerekiyorsa bir sahne noktaları listesi ayarlayın.
- Tüm noktalar odakta olduğunda, kanallar optimize edildiğinde ve döngü süresi ve süresi ayarlandığında görüntülemeye başlayın. Döngü süresi ve görüntüleme süresi deneysel soruya bağlıdır. Amaç, döngü süresini mümkün olduğunca kısa tutmaktır (≤2 dakika) ve 1 dakika, alım dinamiklerinin derinlemesine analizine izin verir.
