T Hücrelerinden Sinaptik Çıktıyı Araştırmak için Boncuk Destekli Lipid Çift Katmanlarının Kullanılması

Özet

Kaynak: Céspedes, P. F., et al. T Hücresi Bağışıklık Sinapslarının Partikül Çıktısını İncelemek için Boncuk Destekli Lipid Çift Katmanlarının Hazırlanması. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu video, sentetik antijen sunan hücrelerin Boncuk Destekli Lipid Çift Katmanları aracılığıyla sulandırılmasını ve bunların aktive edilmiş T hücreleri tarafından üretilen sinaptik çıktıyı değerlendirmedeki uygulamalarını göstermektedir.

Protokol

1. BSLB'lerde protein yoğunluğu kalibrasyonları (Boncuk destekli lipid çift katmanları)

1. 5.00 ±0.05 μm çapında işlevselleştirilmemiş silika boncukları almadan önce, stok çözeltisini iyice karıştırın ve şişelerin dibinde çökelmiş büyük boncuk kümelerini yeniden süspanse edin.
   NOT: Silika boncuklar hızlı bir şekilde tortulaşma eğilimindedir ve bu da sayım hatalarına yol açabilir. Bir P1000 mikropipetin maksimum hacminin yarısını yukarı ve aşağı pipetleyerek kuvvetlice karıştırın.
2. 1.000 μL PBS içinde 1 μL boncuk çözeltisini seyreltin, bir hemositometre odası kullanarak boncukları sayın ve mL.
   başına konsantrasyonlarını hesaplayın not: Silika boncukları görselleştirmek için tripan mavisi boyamaya gerek yoktur.
3. Titrasyon noktası başına 5 × 10⁵ nihai BSLB için gereken silika boncuklarının hacmini hesaplayın.
4. Gerekli hacimde silika boncukları steril 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
5. Silika boncukları 1 mL steril PBS ile üç kez yıkayın ve boncukları RT'de (sabit rpm'de) bir tezgah üstü mikrosantrifüjde 15 saniye santrifüjleyin.
   NOT: Yıkama solüsyonunu çıkarırken, boncuk peletini rahatsız etmekten kaçının. Küçük bir tampon kolonu, lipozom ana karışımını oluşturan lipozomların yayılmasını etkilemeyecektir, çünkü bunlar da PBS'dedir.
6. BSLB'yi yıkanmış silika boncuklar üzerine monte etmek için üç hacim lipozom ana karışımı hazırlayın (örneğin, silika boncukların başlangıçtaki toplam hacmi 20 μL ise, en az 60 μL lipozom ana karışımı hazırlayın).
7. Biotinyl Cap PE mol% titrasyonları için
   1. Biotinyl Cap PE'nin 5 kat seyreltilmesini içeren lipid ana karışımlarını hazırlayın.
      1. 0.4 mM Biotinyl Cap PE mol%'yi %100 DOPC matrisinde seyreltin.
      2. Her bir Biotinyl Cap PE mol% titrasyon noktasını 1: 1 (hacim: hacim) oranında 0,4 mM,% 25 DGS-NTA (Ni) çözeltisi ile karıştırın, böylece tüm titrasyonlarda nihai% 12,5 mol Ni içeren lipitler bulunur.
         not: Ni içeren lipitlerin %12,5 mol'ü (hacim:hacim:%), His etiketli proteinlerin paralel kalibrasyonlarda da test edilebildiği BSLB'lerin karışık lipid bileşimini temsil eder. Örneğin, tüm lipozom stokları aynı molar konsantrasyonda hazırlandığından, 200 μL nihai lipozom karışımında hedef mol% karışımına ulaşmak için, 100 μL 25 mol Ni içeren DGS-NTA'yı 100 μL %100 DOPC ile karıştırın.
   2. 5 × 10⁵ yıkanmış silika boncukları 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın, böylece tüp başına bir Biotinyl Cap PE mol% titrasyon noktası monte edilir.
   3. Biotinyl Cap PE mol% titrasyon ana karışımlarını yıkanmış silika boncuklara ekleyin ve toplam hacmin yarısını yukarı ve aşağı pipetleyerek hafifçe karıştırın. Lipid çift tabakasını fazla tahrip eden kabarcıklar oluşturmaktan kaçının.
   4. Havayı uzaklaştırmak ve karıştırma sırasında lipitleri oksidasyondan korumak için şimdi oluşan BSLB'leri içeren tüpe Argon (veya Azot) gazı ekleyin.
   5. Depolamadan önce 0,4 mM lipid stoklarına Argon ekleyin ve steril bir teknik kullanarak manipüle edin.
      not: Argon/Azot gazı silindirine küçük bir boru bağlayın. Tüplere gaz eklemeden önce, gaz tüpü regülatörünü, basınç 2 psi'den daha yüksek olmayacak şekilde ayarlayın. Lipozom stoğunun içindeki gaz akışını 5 saniye boyunca yönlendirmek için çıkış borusuna steril bir pipet ucu bağlayın ve kapağı hızlı bir şekilde kapatın. Lipid stokları söz konusu olduğunda, 4 °C'de saklamadan önce tüpün kapağını parafin film ile kapatın.
   6. BSLB'leri dikey, değişken açılı bir laboratuvar mikserine taşıyın (Malzeme Tablosuna bakın) ve 30 rpm'lik bir orbital karıştırma kullanarak RT'de 10 dakika karıştırın.
      not: Bu adım, desteklenen lipit çift tabakasının oluşumu sırasında boncukların çökelmesini önleyecektir.
   7. Tezgah üstü bir mini santrifüjde RT'de 15 saniye santrifüjleyerek boncukları döndürün ve ardından fazla lipozomları çıkarmak için 1 mL HBS / HSA (BSA) ile üç kez yıkayın.
   8. NTA bölgelerini doyurmak için 100 μM NiM 4 içeren 1 mL %5 kazein veya %5 BSA ve BSLB'ler üzerindeki tüm biyotin sabitleme bölgelerini homojen bir şekilde kaplamak için 200 nM streptavidin ekleyerek oluşan BSLB'leri bloke edin. Toplam hacmin yarısını yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın ve dikey karıştırıcıda RT ve 20 rpm'de 10 dakikadan fazla olmamak üzere inkübe edin.
   9. Tezgah üstü bir mini santrifüj üzerinde RT'de 15 saniye santrifüjleyerek BSLB'leri döndürün ve ardından 1 mL HBS/HSA (BSA) tamponu ile üç kez yıkayın.
      not: Yıkanmış boncukları, BSLB'leri kaplayan küçük bir hacimde yıkama tamponu ile dikey olarak tutun. Hava lipid çift tabakasını tahrip edeceğinden BSLB'lerin dehidrasyonunu önleyin.
8. DGS-(Ni) NTA içeren BSLB'lerin %12.5'i üzerinde His etiketli proteinlerin titrasyonu için
   1. Son %12.5 mol DGS-NTA(Ni) içeren üç hacim lipozom ana karışımı hazırlayın.
   2. Yıkanmış silika boncukları yeniden süspanse etmek için lipozom ana karışımını kullanın ve toplam hacmin yarısını yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın. Lipid çift tabakasına aşırı zarar veren kabarcıklar oluşturmaktan kaçının.
   3. Havayı uzaklaştırmak ve karıştırma sırasında lipitleri oksidasyondan korumak için şimdi oluşan BSLB'leri içeren tüpe Argon (veya Azot) gazı ekleyin.
   4. Depolamadan önce 0.4 mM lipid stoklarına Argon ekleyin ve steril bir teknik kullanarak manipüle edin.
   5. BSLB'leri dikey karıştırıcıya taşıyın ve 30 rpm'de orbital karıştırma kullanarak RT'de 10 dakika karıştırın.
   6. Tezgah üstü bir mini santrifüjde RT'de 15 saniye santrifüjleyerek boncukları döndürün ve ardından fazla lipozomları çıkarmak için 1 mL HBS / HSA (BSA) ile üç kez yıkayın.
   7. BSLB'lerdeki NTA bölgelerini doyurmak için 100 μM NiSO4 içeren 1 mL %5 kazein (veya %5 BSA) ekleyerek oluşan BSLB'leri bloke edin. Yavaşça karıştırın ve dikey karıştırıcıda RT ve 20 rpm'de 10 dakikadan fazla olmamak üzere inkübe edin.
   8. Fazla blokaj solüsyonunu çıkarmak için HBS/HSA (BSA) kullanarak üç kez yıkayın.
   9. Yeni bir U-tabanlı 96 oyuklu plakada, proteinlerin 2 kat seri dilüsyonlarını hazırlayın.
      1. Toplam 200 μL HBS/HSA (BSA) tamponu hacminde ilgilenilen protein için 100 nM'lik bir başlangıç konsantrasyonu hazırlayın, bu çözeltinin 100 μL'sini ilk sütuna ve kalan 100 μL'yi 100 μL HBS/HSA (BSA) tamponu içeren sütun #2'nin üzerine dağıtın.
      2. 100 μL'yi sütun #2'den sütun #3'e seri olarak aktararak devam edin ve tüm titrasyon noktalarını kapsayacak şekilde gerektiği kadar tekrarlayın. Serinin son sütununu protein olmadan bırakın, çünkü bu, miktar tayini için boş referans olarak kullanılacaktır.
   10. Hazırlanan BSLB'leri, 5 μL HBS/HSA (BSA) tamponunda 5 ×^{10 5} BSLB bulunacak şekilde bir hacimde yeniden süspanse edin.
   11. BSLB süspansiyonunun 100 μL'sini, her bir kuyucuk 5 × 10⁵ BSLB alacak şekilde ikinci bir U-tabanlı 96 kuyulu plakanın kuyularına aktarın.
   12. BSLB'leri içeren ikinci plakayı 300 × g'da 2 dakika aşağı döndürün ve RT'yi atın ve süpernatanı atın.
   13. 100 μL'lik hacimleri protein titrasyon plakasından çökeltilmiş BSLB'leri içeren plakaya aktarın. Nazikçe karıştırın, pipetleme sırasında fazla kabarcık oluşumunu önleyin ve bir plaka çalkalayıcı kullanarak RT'de 30 dakika ve 1.000 rpm'de inkübe edin. Alüminyum folyo ile ışıktan koruyunuz.
   14. RT'de 2 dakika boyunca 300 × g'lık sedimantasyon adımlarını kullanarak plakayı HBS/HSA (BSA) tamponu ile üç kez yıkayın.
   15. Kalibrasyonda kullanılan rekombinant protein doğrudan florokromlara konjuge ise ve bilinen F/P değerlerine sahipse.
   16. Kalibrasyonda kullanılan rekombinant protein etiketlenmemişse veya florokromlara konjuge edilmişse veya MESF boncuk standardı mevcut değilse, protein kaplı BSLB'yi boyamak için bilinen F / P değerlerine sahip Alexa Fluor 488 veya 647 konjuge antikorları kullanın.
   17. Kantitasyon antikorlarının doymuş konsantrasyonları ile lekeleyin.
       NOT: Hedef ekspresyon seviyesine bağlı olarak, bunlar 5 ila 10 μg/mL arasında değişir.
   18. Bir plaka çalkalayıcı kullanarak RT'de 30 dakika ve 1.000 rpm'de boyayın. Alüminyum folyo kullanarak ışıktan koruyun.
   19. RT.
       'da 2 dakika boyunca 300 × g'lık sedimantasyon adımlarını kullanarak HBS / HSA (BSA) tamponu ile iki kez ve bir kez PBS ile yıkayın not: Alımdan önce yıkanmış BSLB'leri yeniden süspanse etmek için PBS, pH 7.4 kullanın. Protein içeren tamponlar kullanmayın, çünkü bu, numunelerin yüksek verimli numune alma cihazlarıyla otomatik olarak karıştırılması sırasında kabarcık oluşumuna yol açar.
   20. Şekil 1B'de (vii) gösterildiği gibi, en parlak tepe noktalarının kantitasyon dedektörü (kanal) için doğrusal algılama aralığında kaldığından emin olarak MESF standartlarını edinin.
   21. Örnekleri manuel olarak veya HTS kullanarak alın. İkincisini kullanıyorsanız, BSLB'leri 100 μL PBS'de yeniden süspanse edin ve 2,5 ile 3,0 μL/sn arasında bir akış hızı, 100 μL'lik bir karıştırma hacmi (veya yeniden süspansiyon hacmi daha azsa toplam hacmin %50'si), 150 μL/s'lik bir karıştırma hızı ve BSLB'lerin monodispersiyon olmasını sağlamak için beş karışım kullanarak 80 μL elde edin.
   22. FCS dosyalarını dışa aktarın.
   23. Analizler için tek olaylara odaklanın (Şekil 2A), çünkü ikililer veya üçlüler belirlemede hatalara neden olacaktır. Protokol adımı 1.2.3'te belirtildiği gibi tek olayların iç içe tanımlamasını kullanın.
   24. Her bir MESF fraksiyonunun (1-4) MFI'sini ölçün ve düzeltilmiş MFI'leri (cMFI) çıkarmak için boş boncukların MFI'sini çıkarın.
   25. MESF standartları için hesaplanan cMFI üzerinden MESF'nin eğimini (b) çıkarmak için doğrusal bir regresyon analizi gerçekleştirin.
   26. Her titrasyon noktasının MFI'sini çıkarın ve cMFI'leri elde etmek için protein içermeyen boncukların MFI'sini çıkarın.
   27. cMFI'leri, her titrasyon noktası için BSLB'lere bağlı MESF'yi çıkarmak için hesaplanan eğime bölün.
   28. BSLB'lere bağlı MESF'yi, BSLB'ye bağlı ortalama molekül sayısını çıkarmak için kantitasyon antikorunun F/P değerine bölün.
   29. BSLB'lerin çapını (5,00 ± 0,05 μm) kullanarak, titrasyon noktası (protein konsantrasyonu) başına proteinin (molec./μm 2) nihai yoğunluklarını hesaplamak için boncuk yüzey alanını (SA =^4pr2) çıkarın.
   30. En uygun çizginin eğimini (b) hesaplamak için protein yoğunluğu üzerinden protein konsantrasyonunun yeni bir regresyon analizini gerçekleştirin.
       not: %12,5 mol DGS-NTA(Ni) konsantrasyonu, T hücrelerinin spesifik olmayan aktivasyonunu indüklemeden veya SLB'lerin yanal hareketliliğini etkilemeden yaklaşık 10.000 molec./μm2 10 maksimum ankraj kapasitesi sağlar.

2. T hücreleri ve BSLB'ler arasında sinaptik transfer deneylerinin yapılması

1. Sinaptik transfer deneyini çalıştırmadan önce
   1. Cihazın floresan spektrum etkileşimlerini tanımlamak için floresan olmayan BSLB'ler, floresan lipidli BSLB'ler, lekelenmemiş hücreler (veya telafi boncukları; Malzeme Tablosuna bakın) ve tek renkli lekeli hücreler (veya telafi boncukları) edinin. Polikromatik paneli yeniden tasarlamak, hassasiyeti artırmak ve kritik dedektörlerde ölçüm hatasını azaltmak için yüksek yayılma yayılımına sahip dedektörlere odaklanın.
   2. Optimal konsantrasyonu bulmak için tespit antikorlarını titre edin, negatiflerin tespitinden ödün vermeden pozitif olayların tespitini sağlayın.
      not: F/P değerleri ve parlaklık partiden partiye değiştiğinden, bir antikor lot değişikliği olduğunda bu adımı tekrarlayın.
   3. İsteğe bağlı: Gürültü üzerinde optimum sinyale yol açan PMT'leri bulmak için numuneyi farklı voltaj aralıklarında (yani bir voltaj yürür) alarak PMT voltajlarını optimize edin (yani, en parlak popülasyonun sinyalinin doğrusal aralıkta kalmasını sağlarken negatiflerin ve pozitiflerin ayrılması).
2. BSLB'lere T hücresi çıkış transferinin ölçümü
   1. % 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS), 100 μM esansiyel olmayan amino asit, 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 100 U / ml penisilin ve 100 μg / mL streptomisin içeren takviye edilmiş RPMI 1640 (burada R10 ortamı) hazırlayın. T hücrelerini kültürlemek ve genişletmek için R10 ortamını kullanın.
   2. 1. günde, T hücrelerini periferik kan veya löredüksiyon sistemi (LRS) odalarından izole edin. İnsan CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin zenginleştirilmesi için immünoyoğunluk hücre izolasyonu ve ayırma kitleri (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın.
   3. Hücreleri, kuyucuk başına toplam 5 mL'den fazla olmayan 6 oyuklu plakalar kullanarak, 10 ila 2.0 × 6 hücre / mL arasında değişen bir nihai konsantrasyonda tohumlayın.
   4. İnsan T hücresi aktivasyonunun 1: 1 oranında (anti-CD3 / anti-CD28) manyetik boncukları kullanarak T hücrelerini aktive edin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve hücre çoğalmasını ve hayatta kalmasını desteklemek için 100 IU rekombinant insan IL-2 ekleyin.
   5. 3. günde, manyetik sütunlar kullanarak aktive edici manyetik boncukları çıkarın (Malzeme Tablosuna bakın). Ek yıkama adımları için hücreleri geri kazanmadan önce manyetik boncukların tüpün kenarlarına bağlı kaldığından emin olun.
   6. Manyetik boncukları 5 mL taze R10 ortamı ile bir kez daha yıkayın, iyice karıştırın ve tekrar mıknatısa koyun. Bu hacmi geri kazanın ve adım 1.2.5'te geri kazanılan hücrelerle karıştırın.
   7. Hücreleri, 100 U / mL IL-2 içeren taze R10'da 1.5-2 × 10⁶ hücre / mL'ye yeniden süspanse edin. Ortamı 48 saat sonra yenileyin, son IL-2 ilavesinin deney gününden 48 saat önce olduğundan emin olun (kültürün 7 ila 14. günleri).
   8. Sinaptik transfer deneyinin yapıldığı gün, Fenol Kırmızısı içermeyen RPMI 1640 ortamını %10 FBS, 100 μM esansiyel olmayan amino asitler, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 100 U/ml penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile takviye ederek Sinaptik Transfer Testi ortamını hazırlayın. Rekombinant insan IL-2'yi dahil etmeyin.
   9. Tripan mavisi boyama veya elektrik akımı dışlaması kullanarak hücreleri sayın ve bunları ortamda 2.5 × 10⁶ hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyona yeniden süspanse edin. Aşırı hücre ölümü gözlenirse (%>10), polisakkarit ve sodyum diatrizoat karışımı kullanarak ölü/ölmekte olan hücreleri çıkarın (Malzeme Tablosuna bakınız):
      1. 13 mL polisakkarit-sodyum diatrizoat çözeltisinin üzerine 15 mL hücre kültürü katmanı.
      2. Minimum hızlanma ve ivme kaybı ile RT'de 20 dakika boyunca 1.250 × g santrifüjleyin. Hücre katmanını (bulut) ortam ile polisakkarit-sodyum diatrizoat çözeltisi arasındaki arayüzde toplayın.
      3. Hücreleri önceden ısıtılmış bir Sinaptik Transfer Testi ortamı ile en az iki kez yıkayın (adım 1.2.7'de hazırlanmıştır).
      4. Bir Sinaptik Transfer Testi ortamı kullanarak hücreleri 2.5 × 10⁶ / mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar sayın ve yeniden süspanse edin. Bu hücre süspansiyonunun 100 μL'sini BSLB'lerle kokültür edin (bkz. adım 1.2.15).
   10. Deney için gereken BSLB sayısını hesaplayın; test edilecek tüm farklı protein ana karışımlarını ve antijen titrasyonlarını göz önünde bulundurun (biyotinile HLA / MHC-peptit monomerleri veya monobiyotinile anti-CD3ε Fab).
   11. Protokol bölümü 5'teki aynı adımları izleyerek BSLB'leri birleştirin, ancak bu sefer karmaşık bir APC membranını yeniden oluşturmak için gereken tüm protein ve lipit titrasyonlarını birleştirin (Şekil 3A). İlk silika boncuk hacmi ile kalibrasyonlar sırasında kullanılan protein karışımının hacmi arasındaki hacim ilişkilerinin yanı sıra BSLB'lerin yüklenmesinde kullanılan süreler ve sıcaklıklar arasında aynı hacim ilişkilerini koruyun. Örneğin, ilk kalibrasyon için 0.5 μL silika boncuk / kuyu ve 100 μL / kuyu protein karışımı kullanılmışsa, BSLB'leri T hücreleri ile birlikte kültürlenecek şekilde hazırlamak için 5: 1.000 hacim: hacim oranlarını koruyun.
   12. BSLB'lere ilgilenilen protein karışımı yüklendikten sonra, fazla bağlanmamış proteinleri çıkarmak için BSLB'leri HBS/HSA (BSA) ile iki kez yıkayın. Her yıkama adımında RT'de 2 dakika boyunca 300 × g sedimantasyon hızlarını kullanın ve süpernatanları atın.
   13. Kuyu başına 5 × 105 BSLB'yi 200 μL'de yeniden süspanse edin.
   14. Kuyu başına nihai BSLB miktarı 2,5 × 10⁵ olacak şekilde bir kopya yapmak için kuyu başına 100 μL'yi yeni bir U-tabanlı 96 oyuklu plakaya aktarın.
   15. BSLB'leri 2 dakika boyunca 300 × g'da döndürün ve süpernatanı RT yapın ve atın.
   16. 100 μL T hücresi süspansiyonu kullanarak BSLB'leri yeniden süspanse edin; kabarcık oluşumunu önlemek için hafifçe karıştırın.
   17. Kokültürleri 37 ° C'de 90 dakika boyunca inkübe edin< > not: Alternatif olarak, hücreler ve boncuklar, kokültür için Fenol-Kırmızı içermeyen RPMI yerine HBS / HSA (BSA) tamponunda yeniden süspanse edilebilir. Bu durumda, inkübasyon, CO₂ olmayan bir inkübatörde gerçekleştirilmelidir, çünkü bu gaz bikarbonat yokluğunda tamponu hızla asitleştirecektir.
   18. BSLB-T hücre kokültürlerini önce hücreleri RT'de en az 15 dakika inkübe ederek soğutun. Onları ışıktan koruyun.
   19. Hücreleri 500 × g ve RT'de 5 dakika santrifüjleyin; süpernatanı atın.
   20. Blokaj için hücreleri RT% 2 BSA-PBS'de (Ca₂ ⁺ ve Mg₂ ⁺ içermez) yeniden askıya alın. Hücreleri 45 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Işıktan koruyun.
   21. Hücreleri inkübe ederken, ekstra blokaj sağlayacak bir boyama tamponu olarak PBS'de buz gibi soğuk 0.22 μm filtrelenmiş %2 BSA kullanarak antikor ana karışımını hazırlayın.
       not: Brilliant Violet boyalara konjuge edilen bazı antikor grupları, BSLB'lere spesifik olmayan bir şekilde bağlanma eğilimindedir. %5 BSA-PBS ile engelleme bu gürültüyü azaltmaya yardımcı olur. Şu andan itibaren, soğuk zinciri kırılmadığından emin olun.
   22. Kokültürleri 500 × g'da 5 dakika ve 4 °C'de döndürün. Süpernatanları atmadan önce, bir arka ışık kullanarak 96 oyuklu plakanın altını inceleyerek peletin mevcut olduğundan kısaca emin olun.
   23. Çok kanallı bir pipet kullanarak, optimize edilmiş antikor konsantrasyonları içeren boyama ana karışımındaki hücreleri yeniden süspanse edin.
       not: Kabarcık oluşumunu ve boyama hacimlerinin dağılımında hataları önlemek için filtresiz pipet uçları kullanın.
   24. İzotip etiketli hücreleri ve BSLB'leri, floresan ve floresan olmayan BSLB'leri ve tek başına boyanmış hücreleri ve BSLB'leri dahil edin. Tüm kontroller için kuyucuk başına toplam olay sayısına uyun (ör., yalnızca 5 × 10⁵ BSLB / kuyucuk içeren BSLB'ler ve lekeli olay başına nispi bir antikor artışını önlemek için yalnızca 5 × 10⁵ hücre / kuyu içeren hücre kontrolleri).
   25. Hacmin yarısını yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. Işıktan koruyun.
   26. Hücreleri ve BSLB'leri buz gibi soğuk %2 BSA-PBS, pH 7.4 ve 500 × g'lık çökeltme adımları kullanarak 4 ° C'de 5 dakika boyunca iki kez yıkayın. Yıkanan kokültürleri 100 μL PBS'de yeniden süspanse edin ve hemen elde edin.
   27. Fiksasyon gerekiyorsa, 10 dakika boyunca PBS'de% 0,5 w / v PFA kullanarak sabitleyin, bir kez yıkayın ve elde edilene kadar PBS'de tutun. Işıktan koruyun.
   28. Tazminattan önce, hem en sönük hem de en parlak popülasyonların doğrusal ölçüm aralığına düşmesini sağlamak için MESF standartlarını edinin.
   29. Ücret örnekleri alın, tazminatı hesaplayın ve ücret matrisini (bağlantı) deneye uygulayın.
   30. Kantifikasyon kanallarının her biri için en az 2 × 10⁴ toplam MESF standardı edinin ve kaydedin.
   31. Yüksek verimli numune alımları kullanarak alım için, cihaz alımını standart olarak ayarlayın, numune alımını 80 μL'ye (veya toplam hacmin %80'i), numune akış hızını 2,0 ile 3,0 μL/sn arasında, numune karıştırma hacmi 50 μL'ye (veya karıştırma sırasında kabarcık oluşumunu önlemek için toplam hacmin %50'si) ayarlayın, 150 μL/sn numune karıştırma, ve kuyu başına 3 ile 5 arasında karıştırma.
   32. Numune başına en az 1 × 10⁴ tek BSLB edinin (referans geçit stratejisi için Şekil 3B panellerine (i)-(vi) bakın).
   33. Cihazı kapatmadan önce sitometreyi 5 dakika boyunca bir temizleme solüsyonu ve ardından 5 dakika ultra saf su ile yıkayın. HTS kullanıyorsanız, HTS sekmesi altındaki seçenekleri ve Temizle seçeneğini izleyin.
   34. FCS dosyalarını dışa aktarın.

3. Parçacıkların BSLB'lere sinaptik transferinin ölçülmesi

1. Deneme FCS dosyalarını açın. Şekil 3B (i)'de gösterildiği gibi, yan ve ileri ışık saçılma alanlarına (SSC-A'ya karşı FSC-A) göre hücre ve BSLB popülasyonunu seçin.
2. Sürekli alım penceresindeki olayları seçin (Şekil 3B (ii)).
3. Hem hücrelerin hem de BSLB'nin tek olaylarına odaklanın; önce FSC-W/FSC-H (singlets-1, Şekil 3B panel (iii)) ve SSC-W/SSC-H (singlets-2; Şekil 3B paneli (iv)). Orantılı FSC-A ve FSC-H ile olayları seçerek ek bir singlets-3 kapısı tanımlayın (Şekil 3B, panel (v)).
4. Her deney numunesi için MESF fraksiyonlarının MFI'sini boş ve 1 ila 4 arasında ve tek hücrelerden ve MESF'den çıkarın.
5. 1'den 4'e kadar olan MESF fraksiyonları için her fraksiyondan boş boncuk popülasyonunun MFI'sini çıkararak düzeltilmiş MFI (cMFI) değerleri oluşturun.
6. Tek BSLB'ler ve hücreler için cMFI'ler oluşturun (bkz. Şekil 3C paneli (i)).
7. İlgili T hücresi belirteçlerine karşı antikorlarla boyanmış BSLB'nin MFI'sini düzeltmek için izotip kontrol antikorları ile boyanmış BSLB'den gelen sinyali kullanın. Şekil 3C panelinde (ii) gösterilen denklemi kullanarak normalleştirilmiş sinaptik transfer yüzdesini (NST%) hesaplamak için cMFI'yi kullanın.
8. Bunun yerine, TCR tetiklemesine yanıt olarak özel olarak aktarılan parçacıklarla ilgileniyorsanız, boş BSLB'lerden gelen sinyali agonistik BSLB'lerin MFI'sinden çıkarın. Şekil 3C panelinde (ii) gösterilen denklemi kullanarak TCR güdümlü NST%'yi hesaplamak için bu cMFI'yi kullanın.
9. T hücresi-BSLB arayüzü boyunca parçacık yükü olarak aktarılan toplam molekül sayısını belirlemekle ilgileniyorsanız, T hücresi-BSLB kokültürleri için aynı cihaz ayarlarını ve edinme oturumunu kullanarak MESF kıyaslama boncuklarını edinin.
10. MESF boncuk popülasyonlarını analiz edin ve cMFI'lerini çıkarın. cMFI üzerinden MESF'nin regresyon analizi için en uygun çizginin eğimini hesaplayın.
11. BSLB'lerde biriken MESF sayısını çıkarmak için hesaplanan eğimi kullanın. Özellikle uyarıcı BSLB'lere aktarılan MESF sayısını çıkarmak için izotip kontrolleri veya boş BSLB kullanılarak hesaplanan cMFI'leri boş olarak kullanın.
12. BSLB başına hesaplanan (ortalama) METF'leri kantitasyon antikorunun F/P değerine bölerek BSLB'lere aktarılan işaretleyici moleküllerinin sayısını hesaplayın.

Sonuçlar

Şekil 1: APC'lerin yüzeyindeki proteinlerin mutlak miktar tayini. (A) Tonsiller B hücrelerinin yüzeyinde ICAM-1'in kantitatif akış sitometrisi ölçümlerine örnek (Foll. Bc) ve yardımcı T hücreleri (TFH). (I-VII) İnsan palatin bademciklerinden izole edilen tek CXCR5 + Bc ve TFH'yi analiz etmek için geçit stratejisi. Gösterilen, sürekli edinme penceresi içinde yer alan t...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
96 Kuyu Hücre Kültasyon Plakası Kapaklı U-alt, Doku kültürü ile tedavi edilmiş, pirojenik olmayan	Yardımcı yıldız®	3799	FCM boyama ve BSLB ve hücrelerin ko-kültürü için.
96 Kuyu Hücre Kültasyon Plakası Kapaklı V-alt, Doku kültürü ile tedavi edilmiş, pirojenik olmayan.	Yardımcı yıldız®	3894	Süspansiyondaki hücrelerin veya boncukların FCM ile boyanması için.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (Süksinimidil Ester)	Thermo Fisher Bilimsel, Invitrogen™	A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)	Thermo Fisher Bilimsel, Invitrogen™	A37573 ve A20006
Multiwell 6 kuyulu Vakumlu gaz plazma ile tedavi edilmiş doku kültürü	doğan	353046	Saflaştırılmış CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin kültürlenmesi ve genişletilmesi için.
Sığır sütünden elde edilen kazein, protein kinaz için substrat için uygun (defosforilasyondan sonra), saflaştırılmış toz
Dynabeads İnsan T-Aktivatör CD3 / CD28	ThermoFisher Bilimsel, Gibco	11132D
DynaMag-2 Serisi	ThermoFisher Bilimsel, Canlandırıcı™	12321D	2 mL'den daha düşük hacimlerde Dynabeads İnsan T-Aktivatörü CD3/CD28'in çıkarılması için
DynaMag-15™	ThermoFisher Bilimsel, Canlandırıcı™	12301D	Dynabeads™ İnsan T-Aktivatörü CD3/CD28'in 15 mL'den daha düşük hacimlerde çıkarılması için
Fetal Sığır Serumu Nitelikli, Bir Sho	ThermoFisher Bilimsel, Gibco	A3160801	56 oC'de 30 dakika boyunca ısı inaktivasyonu gerektirir
anti-insan CD154 (CD40L), klon 24-31	Biyo Efsane	310815 ve 310818	Sırasıyla Alexa Fluor 488 ve Alexa Fluor 647 eşlenikleri
Ermeni Hamster IgG Alexa Fluor 647 İzotip kontrolü, klon HTK888	Biyo Efsane	400902	Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester) ile şirket içinde etiketlenmiştir
BD Sitometre Kurulumu ve İzleme boncukları	Becton Dickinson ve Şirketi (BD)	641319	Kantitatif FCM öncesi enstrümanların performans takibi