Aşağıdaki yöntem, inhibitör üreten suşlarla rakip suşları test etmek için uyarlanmıştır.
>NOT: Bu protokol, bakteri kültürleri ile aerosol oluşturmayı içerir. Bu, yalnızca yerel olarak onaylanmış güvenlik hususlarının uygulanmasıyla kapalı bir alanda gerçekleştirilebilir. Kültürün seviye 2 güvenlik kabini içinde agar plakalarına püskürtülmesi, agar plakalarının ve çevredeki ortamın kirlenmesini en aza indirecektir. Bu aynı zamanda araştırmacıyı püskürtülen bakterilerin aerosol solunmasından da koruyacaktır, araştırmacı muhafaza seviyesi 2 organizmaları kullanıyorsa bu büyük bir endişe kaynağıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir. Petri kabını çevreleyen alan en iyi şekilde tek kullanımlık emici doku ile kaplanır. UV ışığı kullanılarak sprey sonrası dekontaminasyon tavsiye edilir.
1. Agar Plakalarının Hazırlanması
- Beyin kalp infüzyonu (BHI) agarını üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
- BHI agarını sterilize etmek için 121 °C'de, inç kare başına 15 Pound-kuvvette (psi) 20 dakika veya otoklav üreticisinin tavsiyelerine göre otoklavlayın.
- Sterilize edilmiş BHI agarın 15 ml'lik alikotlarını steril petri kaplarına dökün ve sertleşmesine izin verin.
not: Testte kullanılacak her agar plakasının aynı agar stoğundan geldiğinden ve her plakada aynı miktarda agar bulunduğundan emin olun. Bu, mevcut besin maddelerindeki değişkenliği ve plakalar arasındaki inhibitör difüzyonunu sınırlar ve karşılaştırılabilirliğe izin verir.
2. Steril Et Suyu Hazırlama
- BHI suyunu üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
- 28 ml'lik cam üniversal şişelere 10 ml BHI alikotu ekleyin.
- BHI suyunu sterilize etmek için 121 °C'de, 15 psi'de 20 dakika veya otoklav üreticisinin tavsiyelerine göre otoklavlayın.
not: Testlerde değişikliğe neden olabilecek besin maddelerindeki çeşitliliği sınırlamak için tahlilde kullanılan tüm et suyunun aynı anda otoklavlanan aynı et suyu partisinden geldiğinden emin olun.
3. Steril Buharlaştırıcı Şişe(ler)inin Hazırlanması
- Buharlaştırıcı şişesini sökün.
- İç kirleticileri ortadan kaldırmak için buharlaştırıcıdan %5 yüzey aktif temizlik maddesi püskürtün ve buharlaştırıcı şişesini, kapağını ve buharlaştırıcıyı gece boyunca %5 yüzey aktif temizlik maddesine batırın.
not: Yüzey aktif temizlik maddeleriyle çalışırken eldiven ve uygun kişisel koruyucu ekipman kullanılmalıdır.
- Buharlaştırıcıyı, kapağı ve şişeleri steril bir hava akış başlığı altında kurutun.
- Şişeyi %70 etanol ile doldurun, buharlaştırıcıyı yeniden takın ve etanolün bir kısmını buharlaştırıcıdan püskürtün.
- Buharlaştırıcının kapağını kapatın ve etanolü kullanılana kadar içinde saklayın.
- Kullanmadan hemen önce, şişeyi steril BHI suyu ile aseptik olarak durulayın ve suyu buharlaştırıcıdan püskürtün.
not: Bu, etanolün bölüm 6.3'te şişeye eklenen inokulumu etkilemesini önler.
4. Bakteri Gece Kültür(ler)inin Hazırlanması
- Rakip ve inhibitör suşlarını steril bir BHI agar plakasına geçirin ve aerobik olarak yaklaşık 18 saat (gece boyunca) 37 °C'de inkübe edin.
not: Bu plaka, 4 ° C'de saklandığında aynı hafta içinde birden fazla kopya için kullanılabilecek bir bakteri stoğu üretir.
- 10 ml steril BHI suyunu, 28 ml'lik evrensel bir şişe içinde gerekli rakip bakteri suşunun tek bir kolonisi ile aşılayın.
- Üniversal şişeyi bir orbital çalkalayıcıda 250 rpm'de çalkalayarak gece boyunca aerobik olarak 37 °C'de inkübe edin.
5. İnhibitör Üreten İzolatın Spot Kültürü
- Gece boyunca kültür(ler)i bölüm 4'te açıklandığı gibi hazırlayın.
- Aşılamadan önce agar plakalarının tamamen kuru olduğundan ve kapakta yoğuşma olmadığından emin olun (örn. plakayı 37 ° C'de 60 dakika inkübe ederek); Bu, aşılamanın aşılama bölgesinden plaka boyunca yayılmasını önler.
- Gece boyunca 25 μl kültürü agar plakalarının ortasına pipetleyin. Agar boyunca kültür püskürten hava kabarcıklarını önlemek için pipet pistonuna tamamen bastırmaktan kaçının.
- Kültürün yayılmasını sınırlamak için kültürün oda sıcaklığında kurumasına izin verin. Agar plakalarını gece boyunca aerobik olarak 37 °C'de inkübe edin.
6. Test Yarışmacısı Suş(lar)ının Sprey Aşısının Hazırlanması
- Gece kültürünü bölüm 4'te anlatıldığı gibi hazırlayın. Yaklaşık 4 x 106 koloni oluşturan birim (CFU) ml-1 ve OD600 0.3 ±0.05.
süspansiyonu elde etmek için gece kültürünü BHI suyunda 10 kat seyreltin
not: 10 kat seyreltme, tüm bakteri türleri için 4 x 106 CFU ml-1 vermez, 1 x 10-1-1 x 10-6 arasında yayılmış kaplama seri seyreltmeleri ile gerekli seyreltme faktörünü hesaplayın.
- Seyreltilmiş kültürü steril bir plastik parfüm buharlaştırıcı şişesine dökün.
not: Toplam hacim, püskürtülen agar plakalarının sayısı için gerekenden daha fazla olmalıdır. 9 cm çapında bir Petri kabı için plaka başına yaklaşık 250 μl uygundur.
>7. Ertelenmiş Büyüme İnhibisyonu Testi
- Agar üzerine püskürtmeden önce kültürün püskürtme mekanizmasına yüklendiğinden emin olmak için kültürü buharlaştırıcı şişelerinin her birine püskürtün.
- Agarın yaklaşık 15 cm yukarısındaki bir mesafeden, tüm agar yüzeyine yaklaşık 250 μl seyreltilmiş kültür (tipik bir 50 ml buharlaştırıcıdan 3 sprey) püskürtün. Agar plakalarını gece boyunca aerobik olarak 37 °C'de inkübe edin. Aynı sayıda sprey içeren diğer plakalar için tekrarlayın.
8. Ertelenmiş Büyüme İnhibisyonu Test Sonuçlarının Yorumlanması
- Püskürtülen rakip suşun (Şekil 1A-C, "X" ila "X") büyüme inhibisyon bölgesini milimetre cinsinden ölçün, inhibitör üreticisinin merkezi noktasının çapını çıkarın (Şekil 1A-C, "Y" ila "Y").
NOT: Şekil 1E, bu verilerin nasıl sunulabileceğini göstermektedir
- İnhibisyon bölgeleri için netlik skorunu kaydedin.
not: Bu, gözlenen inhibisyon derecesini gösterir. Örnekler Şekil 1A-D'de gösterilmiştir, standardizasyon için kullanılabilecek suşlar temsili sonuçlar bölümünde önerilmiştir. Netlik puanlaması için aşağıdaki ölçek kullanılabilir: rakip suşun büyümesinin tamamen engellendiği bir bölgeyi tanımlamak için 0'lık bir netlik puanı. 1 puanı, büyümenin neredeyse tamamen engellendiği bir bölgeyi tanımlar ve temizleme bölgesinde yalnızca bireysel koloniler bulunur. 2 puan, görünür bir azalmış büyüme bölgesini tanımlar, bu bölge içindeki büyüme birleşiktir veya birleşiktir, ancak yoğunluğu %>50 oranında azalır. 3 puan, yalnızca minimum büyüme azalmasını tanımlar, büyüme birleşiktir ve %50'den daha az azalır ve bir bölge hala görünür ve ölçülebilirdir. 4 puan, büyümenin gözle görülür bir şekilde engellenmediğini tanımlar. 5 puan, rakip suşun büyümesinin, test inhibitörü üreten suşun yakınında arttığını açıklar. Örnekler için Şekil 1'e bakın. Bu puanlar deneyci için özneldir.
