Enfekte Primer Makrofajlarda Sitozolik ve Vakuolar Salmonella'yı Ölçmek İçin Bir Test

Özet

Kaynak: Meunier, E., et al. Diferansiyel Permeabilizasyon ile Primer Makrofajlarda Sitosolik ve Vacuolar Salmonella'nın Miktar Tayini. J. Vis. Uzm. (2015).

Bu videoda, diferansiyel geçirgenlik kullanılarak kemik iliği türevli makrofajlar içindeki sitozolik ve vakuolar Salmonella typhimurium miktarını belirlemek için bir test gösterilmektedir. Makrofajlar, Salmonella içeren vakuol veya SCV adı verilen özel bir vakuolar yapı içinde içselleştirilen floresan proteini eksprese eden bir Salmonella ile enfekte edilir. Bir bakteri alt kümesi SCV'den kaçar ve sitozole girer. Makrofajların kolesterol açısından zengin plazma zarı, dijital onin kullanılarak geçirgen hale getirilir ve SCV'yi sağlam bırakır. Sitozolik bakterileri floresan etiketli bir antikor ile etiketledikten sonra, vakuolar ve sitozolik bakterilerin yüzdesi, floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) kullanılarak ölçülür.

Protokol

1. mCherry eksprese eden Salmonella ile Digitonin Testi (FACS tabanlı Analiz)

1. Bakteri
   hazırlama Not: Bu testte bir plazmitten (rpsM promotörü altında mCherry'yi kodlayan pFPV kodlaması) mCherry eksprese eden Salmonella vahşi tip SL1344 (Streptomisin dirençli) kullanılır. Bakteriyel fagositoz ve proliferasyon, mCherry'nin yapısal ekspresyonu ile değiştirilmedi (veriler gösterilmemiştir).
   1. Suşu, enfeksiyondan 1 gün önce Streptomisin (90 μg / ml) ve Ampisilin (100 μg / ml, mCherry eksprese vektörü) ile takviye edilmiş 3 ml LB ortamında 37 ° C O / N'de bir çalkalayıcıda aşılayın.
2. Enfeksiyon için kaplama hücreleri.
   1. 1.25 x 10⁵ hücre / kuyu yoğunluğunda 24 oyuklu bir plakada 1 ml birincil makrofaj ortamında tohum vahşi tip BMDM'ler (% 10 Fetal Buzağı Serumu (FCS, ısıyla etkisizleştirilmiş, 56 ° C, 30 dakika),% 1 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES),% 1 Esansiyel olmayan amino asitler (NEAA),% 1 L-Glutamin ve% 10 L929 süpernatant (makrofaj koloni uyarıcı faktörden (M-CSF) koşullandırılmış ortam) L929 hücreleri üreten). Tablo 1'e göre tohum kuyuları bireysel koşulları hesaba katmaktadır. Kontrol olarak kullanılan kuyucuklara lameller ekleyin (Tablo 1).
   2. Hücreleri gece boyunca 37 ° C ve% 5 CO_2'de bir inkübatörde inkübe edin.
3. Bakterileri enfeksiyona hazırlamak.
   1. Ertesi gün, kültürü fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1:10 oranında seyrelterek ve OD_600'ü yalnızca PBS kontrolüne karşı ölçerek gece boyunca kültürdeki Salmonella konsantrasyonunu belirleyin. Bu, OD_600'ün spektrofotometrenin doğrusal aralığında ölçülmesini sağlar.
   2. Ml başına Salmonella konsantrasyonunu hesaplayın. 1'in_{OD 600'ü}, 1 x 10⁹ bakteriye karşılık gelir.
   3. 1.25 x 10⁶ hücre / ml'lik bir Salmonella konsantrasyonuna ulaşmak için bakterileri bir makrofaj ortamında seyreltin.
4. Salmonella ile hücrelerin enfeksiyonu.
   1. Enfekte olmamış kontrol kuyucuklarına (B1-B3, C1-C3) 1 ml makrofaj ortamı ekleyin. Hücre başına 10 bakterilik bir enfeksiyon bolluğuna (m.o.i.) ulaşmak için A1 - A5 kuyularına 1 ml Salmonella süspansiyonu ekleyin.
   2. Enfeksiyonu senkronize etmek için plakayı 37 ° C'de 300 x g'de 15 dakika santrifüjleyin. Plakayı 37 °C ve% 5 CO_2'de bir inkübatöre aktarın.
5. Gentamisin ile hücre dışı Salmonella'yı öldürmek.
   1. Enfeksiyondan 1 saat sonra, plakayı inkübatörden çıkarın ve hücre dışı bakterileri öldürmek için 0.1 mg / ml Gentamisin içeren 0.1 ml makrofaj ortamı ekleyin. Tüm hücrelerin aynı şekilde tedavi edildiğinden emin olmak için tüm kuyucuklara, hatta enfekte olmamış kontrollere bile Gentamisin ekleyin. Plakayı 37 °C ve% 5 CO_2'de bir inkübatöre aktarın.
6. Hücreleri yıkamak.
   1. Enfeksiyondan 2 saat sonra, plakayı inkübatörden çıkarın ve tüm kuyucukları 2x 1 ml düz DMEM (37 ° C'ye önceden ısıtılmış) ile yıkayın ve kalan hücre dışı bakterilerin büyümesini önlemek için 10 μg / ml Gentamisin içeren makrofaj ortamı (37 ° C'ye önceden ısıtılmış) ile değiştirin. Plakayı 37 °C ve% 5 CO_2'de bir inkübatöre aktarın.
7. Deterjanlar ve antikorlar ile taze tamponlar hazırlamak.
   1. İstenen analiz zaman noktasından hemen önce, KHM Tamponunda (110 mM potasyum asetat, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl₂, pH 7.3) 1 mg / ml'de taze bir digitonin stok çözeltisi hazırlayın. Stoğu süzün ve KHM tamponunda 50 μg/ml digitonin çalışma konsantrasyonuna kadar seyreltin. Ek olarak, KHM Tamponunda %0.1 Saponin, 1/500'de floresein İzotiyosiyanat (CSA-1-FITC) ile birleştirilmiş anti-Salmonella antikoru, 1/100'de anti-kalneksin veya 1/100'de anti-protein disülfid izomeraz (anti-PDI) çözeltisi hazırlayın
   .
8. Hücre geçirgenliği.
   1. Plakayı inkübatörden çıkarın ve 0,5 ml KHM Tamponu (önceden 37 ° C'ye ısıtılmış) ile kuyuları 3x yıkayın. KHM Tamponunu çıkarın ve A4 ve B1/C1 kuyularına 0,25 ml düz KHM Tamponu, A1 - A3 ve B2/C2 kuyularına digitoninli KHM Tamponu veya A5 ve B3/C3 kuyularına saponinli KHM Tamponu ekleyin (Tablo 1'e göre). RT'de tam olarak 1 dakika inkübe edin ve hemen tüm kuyucukları 3x 0.5 ml KHM Tamponu (37 ° C'ye önceden ısıtılmış) ile yıkayın.
9. Birincil antikor boyama.
   1. KHM Tamponunu çıkarın ve birincil antikor çözeltilerini (Keçi anti-Salmonella-FITC, 250 μl / kuyu, 0.1 μg / ml) uygun kuyucuklara ekleyin (Şekil 1, Tablo 1). Plakayı 37 ° C ve% 5 CO_2'de bir inkübatörde 15 dakika inkübe edin.
   2. Hücreleri 1 mL PBS ile 1 kez yıkayın.
10. Enfekte Hücreler (A1 - A5 kuyuları): FACS analizi
    1. Hücreleri 3x PBS ile yıkayın ve% 0.1 Triton içeren 0.5 mL buz gibi soğuk PBS ekleyin. Hücre agregalarını parçalamak için hücre süzgeç kapaklı 5 mL'lik bir FACS tüpüne aktarın. Numuneleri buz üzerinde tutun.
    2. FACS örneklerini analiz edin. Tamamen geçirgen kontrolleri kullanarak, önce ileri ve yan saçılmaya (FSC / SSC) ve mCherry sinyaline (610 nm ± 20 nm filtre) dayalı toplam bakteri için kapıyı ayarlayın.
    3. Daha sonra, sitozolik bakteriler (FITC+, mCherry +) ve vakuolar bakteriler (FITC-, mCherry +) için kapıları ayarlamak için tamamen geçirgen ve geçirgen olmayan kontrolleri kullanarak toplam bakteri popülasyonundaki FITC sinyalini analiz edin (Şekil 2).
    4. Kapılar ayarlandıktan sonra, numuneleri analiz edin ve üreticinin protokolüne göre FlowJo yazılımını kullanarak sitozolik ve vakuolar bakteri yüzdesini belirleyin.

Tablo 1: Kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMDM'ler) için müteakip Salmonella enfeksiyonu, geçirgenlik ve boyama için 24 oyuklu bir formatta kaplama şeması.

		Geçirgenlik		Boyama
	Cam lamel	Salmonella	Sayısallık	Saponin	anti-Salmonella	anti-Calnexin	anti-PDI
A1 (örnek)	-/+*	+	+		+
A2 (örnek)	-/+*	+	+		+
A3 (örnek)	-/+*	+	+		+
A4 (geçirgenlik kontrolü yok)	-/+*	+			+
A5 (tam geçirgenlik kontrolü)	-/+*	+		+	+
B1 (kalneksin için lekeli)	+					+
B2 (calnexin için lekeli)	+		+			+
B3 (kalneksin için lekeli)	+			+		+
C1 (PDI için lekeli)	+						+
C2 (PDI için lekeli)	+		+				+
C3 (PDI için lekeli)	+			+			+

Sonuçlar

Şekil 1. Protokol 1'in şematik gösterimi. Bozulmamış vakuollerde veya sitozolde mCherry pozitif Salmonella içeren enfekte hücreler, digitonin ile diferansiyel olarak geçirgenir. Sitozolik Salmonella, FITC'ye bağlı anti-Salmonella ile boyanır. Hücreler FACS analizi için Triton X-100 ile yıkanır ve parçalanır. Negatif kontrol hücreleri geçirgen hale gelmezken, pozitif kontrol ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sayısallık	Sigma	D5628	50ug/mL
PFA (Üstün Başarı T	mpbio (mpbio	219998380
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Yaşam Teknolojileri	15630
Potasyum Asetat	Sigma	791733
MgCl2	Sigma	M8266
Bsa	Sigma	A2153
anti-Salmonella CSA-1-FITC	KPL (Türkçe)	01-91-99-MG	1/500
anti-Salmonella CSA-1	KPL (Türkçe)	02-91-99-MG	1/500
anti-Calnexin	Enzo Yaşam Bilimleri	SPA-860D	1/100
anti-PDI	Enzo Yaşam Bilimleri	SPA-890	1/100
Saponin	Sigma	47036
Vectashield montaj ortamı	Vektör Laboratuvarları	H-1200
Anti Tavşan antikoru-488	Moleküler Problar	A-11070	1/500
Gentamisin	Yaşam Teknolojileri	15710-49	100ug/mL ve 10ug/mL
Triton X-100	Promega	H5141
Pbs	Gibco (Gibco)	20012-019
DMEM (Ömer Çiçeğ	Sigma	D6429
NEAA (NEAA)	Amimed	5-13K00-H
FACS Fortessa	BD teknolojileri		algılama mCherry 610 nm
FACS Fortessa	BD teknolojileri		algılama FITC 530 nm

Serisi ) Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Fuar Serisi Serisi