NOT: Bölüm 1 ve 2'de açıklanan tüm adımlar, laminer akış kabininde steril koşullar altında gerçekleştirilir.
>1. U87'nin bakımı. CD4.hCXCR4 Hücreleri
- Hücreleri T75 kültür şişelerinde 37 ° C'de ve% 5 CO2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde büyütün.
not: Bu protokolde kullanılan in vitro hücre hattı, farklılaşma 4 (CD4) ve insan CXC kemokin reseptörü 4'ü (CXCR4) stabil bir şekilde eksprese eden bir U87 glioblastoma hücre hattıdır ve daha önce tarif edilmiştir. CD4 ve CXCR4'ün hücre yüzeyi ekspresyonu akış sitometrisi ile sürekli olarak izlenir ve ekspresyon seviyeleri zaman içinde sabit kalır (~% 100 CD4 + ve ~% 100 CXCR4 + hücreleri). Kullanılan hücre hattının oluşumunun ve reseptör ekspresyon seviyelerini araştırmak için akış sitometrisi prosedürünün ayrıntılı bir açıklaması bu protokolün kapsamında değildir.
- % 80-85 birleşmede subkültür hücreleri. Hücre kültüründen önce tüm reaktiflerin oda sıcaklığına (RT) ulaşmasına izin verin.
- Şartlandırılmış kültür ortamını hücrelerden çıkarın ve hücre tek tabakasını 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir kez yıkayın.
- 3 mL %0.25 tripsin-etilendiamin tetraasetik asit (tripsin-EDTA) ekleyin ve hücre tek tabakası üzerine eşit olarak dağıtın. Daha sonra fazla tripsin-EDTA'yı çıkarın ve hücreler ayrılmaya başlayana kadar 37 ° C'de 5 dakikaya kadar inkübe edin.
- 10 mL taze tam büyüme ortamı ekleyin (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) +% 10 fetal sığır serumu (FBS) + 0.01 M4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) + uygun seçim ajanları). Hücreleri nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu steril 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Tercih edilen bir yöntem kullanarak canlı hücrelerin sayısını sayın. U87 glioblastoma hücreleri söz konusu olduğunda, canlılık genellikle ~% 100'e ulaşır.
not: Hücre numaraları çeşitli şekillerde belirlenebilir. Rutin olarak, standart işleme prosedürlerine göre tripan mavisi boyamaya dayalı otomatik bir hücre analiz sistemi kullanıyoruz (Malzeme Tablosuna bakınız), ancak diğer yöntemler de eşit derecede iyi çalışmalıdır.
- Bir T75 kültür şişesinde 25 mL taze büyüme ortamının son hacmine 2 x 10,6 veya 3 x 106 (canlı) hücre ekleyin ve 37 ° C ve% 5 karbondioksitte (CO2) inkübe edin><.
not: 3 x 10,6 hücre kullanılırsa, hücreler 2 gün sonra% 80-90 birleşmeye ulaşacaktır. 2 x 106 hücre kullanılırsa, 3 gün sonra aynı birleşmeye ulaşırlar. Hücrelerin büyüme hızı, diğer hücre hatları kullanılıyorsa öncelikle ampirik olarak belirlenmelidir.
2. Ca2+ mobilizasyon testi için hücrelerin tohumlanması
- Hücre geçişinin olduğu gün (0. gün), hücre bağlanmasını kolaylaştırmak için siyah duvarlı polistiren 96 oyuklu plakaları şeffaf diplerle kaplayın (Malzeme Tablosuna bakınız)% 0.1 jelatin çözeltisi ile.
not: 96 oyuklu plakaların jelatin ile kaplanması, ticari olarak temin edilebilen önceden kaplanmış plakalar kullanılıyorsa (bkz. Malzeme Tablosu) ihmal edilebilir. Protokole devam etmeden önce, incelenen her hücre hattı için manuel kaplama yerine önceden kaplanmış plakaların kullanımının değerlendirilmesi önerilir.
- % 1'lik bir çözelti elde etmek için 100 mL PBS'ye 1 g jelatin ekleyerek jelatin çözeltisi hazırlayın. Daha fazla kullanmadan önce PBS ile 10 kat seyreltin. Jelatinin çözünürlüğünü artırmak için çözeltiyi 37 °C'ye ısıtın.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak 96 oyuklu plakanın oyuğu başına 100 μL %0.1 jelatin çözeltisi ekleyin. RT'de 2 saat inkübe edin.
- Bu arada, hücreleri kaplanmış 96 oyuklu plakada tohumlama için hazırlayın.
- Hücreleri kültür şişesinden ayırın, taze büyüme ortamında yeniden süspanse edin ve tripan mavisi boyama yöntemini kullanarak sayın.
- Hücreleri 50 mL'lik bir tüpte RT'de 400 x g'da 5 dakika boyunca döndürün.
- 0.1 x 106 (canlı) hücre / mL'lik bir hücre yoğunluğu elde etmek için hücreleri taze bir büyüme ortamında (DMEM +% 10 FBS +% 1 HEPES, antibiyotik yok) yeniden süspanse edin.
- Jelatin çözeltisini, plakayı ters çevirerek ve bir doku üzerinde kurutarak şeffaf bir tabana sahip siyah duvarlı plakalardan çıkarın. Fazla jelatini çıkarmak için 200 μL/kuyucuk PBS ekleyin ve plakayı tekrar ters çevirin.
- Jelatin kaplı 96 oyuklu plakada (bundan böyle bu plaka bundan sonra "ölçüm plakası" olarak anılacaktır) her oyuk için 200 μL hücre süspansiyonu (0.2 x10 5 hücreye karşılık gelir) dağıtın.
- Plakayı gece boyunca 37 °C ve %5 karbondioksitte (CO2 ) inkübe edin.
3. Hücrelerin Floresan Ca2+ Duyarlı Boya ile Yüklenmesi
- 1. günde, tohumlanan hücrelerin floresan Ca2 + bağlayıcı boya fluo-2 asetoksimetil (fluo-2) ile yüklenmesinden başlayarak gerçek Ca2 + mobilizasyon testini gerçekleştirin.
- 200 mL Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisine (HBSS, 10x, fenol kırmızısı yok, sodyum bikarbonat yok) 40 mL HEPES (1 M) ekleyerek tahlil tamponu hazırlayın. 2 L'lik bir son hacim elde etmek için ultra saf su ekleyin ve 4 g sığır serum albümini (BSA) ekleyin. BSA'yı manyetik karıştırma yoluyla çözün. PH'ı 7.4'e ayarlayın (sodyum hidroksit, NaOH ile) ve çözeltiyi süzün.
not: Takip eden tüm adımlar sırasında, "tahlil tamponu" olarak adlandırılan aynı tampon kullanılır.
- Floresan Ca4 + duyarlı boya fluo-2'nin bir stok çözeltisi (dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 2 mM) hazırlayın. Işığa aşırı maruz kalmaktan kaçının. 1 mg fluo-2'yi (moleküler ağırlık: 1.061 g / mol) 235.6 μL DMSO'da çözün.
- Fluo-2'nin çalışan bir çözümünü hazırlayın. Bir 96 oyuklu tahlil plakası için 12.5 μL fluo-2 stok çözeltisi (4 mM) ve 12.5 μL noniyonik yüzey aktif madde poliol (örneğin, pluronik f-127) çözeltisini (DMSO'da %20 ağırlık/hacim) karıştırın, bkz. Bu karışımın 22 μL'sini 15 mL'lik bir tüpte 11 mL'lik tahlil tamponuna ekleyin. Fluo-2'nin son konsantrasyonu 4 μM'dir.
not: İyonik olmayan yüzey aktif madde, fluo-2'nin sulu çözünürlüğünü iyileştirmek ve sonuç olarak hücre yüklemesini arttırmak için bir dispersiyon ajanı olarak kullanılır. Yüzey aktif maddeyi DMSO'da çözündürmek için numuneyi 37 °C'de ısıtın ve homojen bir çözelti elde etmek için düzenli olarak karıştırın.
- Büyüme ortamını, plakayı ters çevirerek ve bir kağıt havlu üzerinde kurulayarak 96 oyuklu ölçüm plakasındaki önceden ekilmiş hücrelerden çıkarın.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak oyuk başına 100 μL yükleme boya çözeltisi ekleyin ve karanlıkta RT'de 45 dakika inkübe edin.
4. Kemokin Ligandı CXC kemokin ligandı 12 (CXCL12) veya İncelenen Bileşikleri İçeren 96 Kuyulu Polipropilen Plakaların Hazırlanması
- Yuvarlak tabanlı polipropilen (PP) 96 oyuklu plakalar elde edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
- CXCL12'nin (1 mg / mL) stok çözeltisinin ve incelenen bileşiklerin stok çözeltisinin RT'de dengelenmesine izin verin.
not: CXCL12'nin stok çözeltisi, %0.01 Tween20 ile takviye edilmiş ultra saf suda hazırlanır ve -20 °C'de tek kullanımlık alikotlar olarak saklanır.
- Tahlil tamponunda (31.25 nM'ye eşit olan 250 ng/mL) 5x konsantre CXCL12 çözeltisi ve her bileşiğin 5x konsantre seyreltmesini (tahlil tamponunda) hazırlayın.
- Stok çözeltilerini, önceden tanımlanmış bir plaka düzenine göre uygun 96 oyuklu plakaya dağıtın. CXCL12 ("kemokin plakası") içeren plakaya 75 μL/kuyucuk dağıtın ve bileşikleri içeren plakaya ("bileşik plaka") 50 μL/kuyucuk dağıtın.
not: Hem bileşikler hem de CXCL12, ölçüm plakasında dağıtıldıktan sonra nihayet 5 kat seyreltilecektir. Hem bileşik plakada hem de kemokin plakasında sadece tahlil tamponu içeren negatif kontrol kuyularının dahil edilmesi de önemlidir. Ayrıca, pozitif kontrol kuyularının dahil edilmesi gerekir (yani, kemokin plakasında CXCL12 içeren, ancak bileşik plakanın karşılık gelen kuyucuklarında tahlil tamponu bulunan kuyucuklar).
5. Floresan Mikroplaka Okuyucudaki Protokol Ayarları
>NOT: Bu protokolde kullanılan floresan mikroplaka okuyucusuna Malzeme Tablosunda atıfta bulunulmuştur.
- Önce floresan plaka okuyucunun soğutucu ünitesini açın ve ardından floresan okuyucunun kendisini açın. Birkaç dakika başlatalım ve sistemin yazılımını açalım.
- Aşağıdaki adımları içeren sürükle ve bırak menüsünü kullanarak tahlilin protokolünü oluşturun:
- "Ayarlar" kutusunda, uyarma dalga boyuna sahip 'Read_Mode'yi seçin: 470-495 nM; ve emisyon dalga boyu: 515-575 nM.
not: Seçilen dalga boyları, Ca2 + duyarlı boya fluo2 ile kullanım için uygundur.
- Cihazın kaynak 2 konumuna yerleştirilecek olan bileşik plakadaki bileşiklerin otomatik olarak karıştırılması için "TF ile Karıştır" (transfer sıvısı) kutusunu dahil edin (bkz. adım 6.4). Otomatik olarak aspire edilecek ve üç kez karıştırılacak her kuyucuğumuzda 15 μL çözelti seçin. Pipet uçlarının yüksekliğini sıvı yüzeyinin 20 μL altına ayarlayın. Aspirasyon ve dağıtım hızını 50 μL/s'ye ayarlayın.
not: Pipet uçlarının yüksekliği, pipet uçlarının altında kalan hacmi ifade eder. Örneğin, bir bileşik plakanın kuyucukları 50 μL içeriyorsa, 30 μL'lik bir yükseklik, sıvı yüzeyinin altında 20 μL'ye karşılık gelir. Karıştırmak için alınan bileşik çözeltinin hacmi, karıştırma hızı, karıştırma sırasında pipet uçlarının konumu ve karıştırma döngülerinin sayısı yazılım kullanılarak ayarlanabilir.
- "Transfer Sıvısı" kutusunda, bileşik plakadan gelen her bir kuyucuğun 20 μL'sinin ölçüm plakasına aktarılacağını tanımlayın. Pipet uçlarını sıvı yüzeyinin 20 μL altına, yani bileşiklerin aspirasyonu sırasında 30 μL yüksekliğe ve ölçüm plakasına yerleştirme sırasında 60 μL yüksekliğe yerleştirin. Aspirasyon hızını 50 μL/s'ye ve dağıtım hızını 25 μL/s'ye ayarlayın.
not: Bileşik plaka, kuyucuk başına 50 μL çözelti içerir (bkz. adım 4.1.3), bu nedenle 30 μL'lik bir yükseklik, sıvı yüzeyinin 20 μL altındaki bir konuma karşılık gelir. Ölçüm plakası, kuyucuk başına 80 μL tahlil tamponu içerecektir (bkz. adım 6.3), bu nedenle 60 μL'lik bir yükseklik, uçların benzer bir konumuna karşılık gelir.
- "TF ile Oku" düğmesini seçin. İlk aralık sırasında, 1 s'lik bir okuma aralığı süresine sahip 60 okuma (floresan ölçümleri) seçin. Bileşikleri ölçüm plakasına dağıtmadan önce 10 okumanın ve daha sonra 50 okumanın kaydedildiğini tanımlayın. 30 saniyelik bir okuma aralığı süresi ve 18 okuma ile ikinci aralığı tanımlayın.
not: Bu adım sırasında, floresan toplamda ~ 10 dakika boyunca kinetik olarak (tanımlanan zaman aralıklarında) ölçülecektir.
- Protokole "Yıkama İpuçları" düğmesini üç kez ekleyin. Her yıkama adımında sıvı türünü seçin: sıvı A (ultra saf su) veya sıvı B (%70 etanol), yıkama döngüsü sayısı (1), pompa hızı (Hızlı) ve her yıkama adımında strok sayısı (5).
not: İlk ve son yıkama adımlarında sıvı A kullanılır, ikinci yıkama adımında sıvı B kullanılır.
- "Pipetleyiciyi Duraklat" işlevini ekleyin. Pipetleyiciyi 300 s.
duraklatacak şekilde ayarlayın
not: Bu adımın protokole dahil edilmesiyle, floresan plaka okuyucu cihaza entegre edilen pipetleyici kafası, protokole devam etmeden önce 5 dakika duraklayacaktır.
- CXCL12 çözeltisinin, cihazın kaynak 3 konumuna yerleştirilecek olan kemokin plakasında otomatik olarak karıştırılmasına izin vermek için "TF ile Karıştır" kutusunu dahil edin (bkz. adım 6.4). Otomatik olarak aspire edilecek ve üç kez karıştırılacak her kuyucuğumuzda 15 μL çözelti seçin. Aspirasyon ve karıştırma sırasında pipet uçlarını sıvı yüzeyinin 20 μL altına yerleştirin. Aspirasyon ve dağıtım hızı 50 μL/s olarak ayarlanmıştır.
not: Adım 5.2.2'ye benzer şekilde, bu parametreler ayarlanabilir.
- Sonraki "Transfer Sıvısı" kutusunda, kemokin plakasının her bir oyuğundan 25 μL'nin ölçüm plakasına aktarılacağını tanımlayın. Uçları sıvı yüzeyinin 20 μL altına, yani 75 μL/kuyucuk içeren kemokin plakasından aspirasyon sırasında 55 μL yüksekliğe (bkz. adım 4.1.3) ve ölçüm plakasında dağıtım sırasında 80 μL yüksekliğe yerleştirin. Aspirasyon hızını 50 μL/s'ye ve dağıtım hızını 25 μL/s'ye ayarlayın.
- "TF ile Oku" düğmesini ekleyin. İlk aralık sırasında, 1 sn okuma aralığı süresiyle 145 okuma seçin. CXCL5'yi ölçüm plakasına dağıtmadan önce 12 okumanın ve daha sonra 140 okumanın kaydedildiğini tanımlayın. 6 s'lik bir okuma aralığı süresiyle ikinci aralığı tanımlayın ve 20 okuma.
seçin
not: Birlikte ele alındığında, tüm protokol boyunca 243 okuma (floresan ölçümleri) kaydedilir: 78 adım 5.2.4'te ve 165 adım 5.2.9 sırasında.
- Adım 5.2.5'e benzer şekilde, protokole üç kez "Yıkama uçları" düğmesini ekleyin.
not: Bu adımın protokolün sonuna dahil edilmesi, uçların değiştirilmesine gerek kalmadan başka bir tahlil gerçekleştirmek için uçların yeniden kullanılabilmesine olanak tanır.
- "Sahne sıcaklığını ayarla" düğmesine tıklayarak ve 37 °C'yi seçerek cihazın sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın.
6. Floresan Testini Çalıştırma
- Ölçüm plakası 45 dakika boyunca yükleme tamponu ile inkübe edildikten sonra (bkz. adım 3.1.5), plakayı ters çevirerek tamponu çıkarın ve bir doku üzerinde kurutun.
- Tohumlanan hücreleri 150 μL / kuyu tahlil tamponu ekleyerek yıkayın ve 2 dakika inkübe edin.
- Plakayı ters çevirerek tamponu tekrar çıkarın. Çok kanallı bir pipet ile 80 μL/kuyucuk tahlil tamponu ekleyin.
- Tüm plakaları cihaza uygun konumlarında yerleştirin: kaynak 2 konumunda bileşik plaka, kaynak 3 konumunda kemokin plakası ve okuma konumunda ölçüm plakası. Kaynak 1 uç konumuna bir kutu siyah uç koyun. Cihazın kapısını kapatın ve protokole devam etmeden önce 5 dakika inkübe edin.
- Plaka üzerindeki arka plan bağıl ışık birimlerini (RLU'lar) ve floresan varyansını belirlemek için "Protokol sinyali testi" düğmesini seçin. Yeni bir pencere açılacaktır. "Test sinyali"ni seçin.
not: Bu adım sırasında, arka plan RLU'ları, floresan okuyucu cihazının optik bölmesine entegre edilen yoğunlaştırılmış şarj bağlantılı cihaz (ICCD) kamerası tarafından belirlenir. Bu RLU'lar, Ca2+'ya duyarlı boyanın (fluo-2) ışık yayan diyotlar (LED'ler) (LED çıkış dalga boyu 470-495 nm) tarafından uyarılmasından kaynaklanır. 8.000-10.000 RLU değerleri bu uygulama için çok uygundur. RLU'lar, gerekirse, uyarma yoğunluğu (Yoğunluğu Seç) veya kamera kapısı (Kapı Açık'ı Seç) değiştirilerek uyarlanabilir. Plaka üzerindeki varyans ideal olarak %7,5'ten az olmalıdır.
- 8.000-10.000 RLU'luk arka plan değerleri elde edilirse "Güncelle"yi seçin. Kaydet düğmesine tıklayarak ana protokolü kaydedin.
not: Bunu yaparak, protokol sinyal testindeki ayarlar ana protokole taşınacaktır.
- "RUN" düğmesine basarak testi çalıştırın.
