1. Hücre Hasadı ve α-galaktosidaz A veya Asit α-glukozidaz Aktivitesi Ölçümü
- Hücre hasadı
- Hasat gününde, hücreleri inkübatörden çıkarın ve ortamı aspire edin. Hücreleri PBS ile 2 kez Ca2+ ve Mg2 +
dikkatlice yıkayın
NOT: Bu adım kritiktir, çünkü DGJ ve DNJ sırasıyla α-galaktosidaz ve α-glukozidazın güçlü inhibitörleridir ve herhangi bir kalıntı testi geçersiz kılacaktır.
- Doğrudan hücrelerin üzerine 200 μL deiyonize su ekleyin. Hücreleri plakadan durulayın ve 1.5 mL'lik bir reaksiyon tüpüne aktarın.
2. Dondurma ve çözme ile homojenizasyon
- Numuneleri uygun bir köpük rafa koyun ve lizisi daha verimli hale getirmek için 5 saniye boyunca girdaplayın. Numuneleri dönüşümlü olarak 10 saniye boyunca sıvı nitrojen içinde ve çözülme tamamlanana kadar (5 dakika) oda sıcaklığında bir su banyosuna koyun.
- Bu prosedürü 5 kez tekrarlayın ve ardından numuneleri 10.000 x g'da 5 dakika döndürün. Süpernatanı ve pipeti yeni bir reaksiyon tüpünde tutun.
3. Bikinkoninik asit (BCA) testi kullanılarak protein konsantrasyonu tayini
- Her numune için 40 μL deiyonize H2O içeren taze bir tüp hazırlayın ve numuneden 10 μL ekleyin. Çözeltiyi kısaca girdaplayarak karıştırın ve 10 μL'yi 96 oyuklu bir plakanın boşluğuna aktarın (her numune üç kopya halinde). Standart bir eğri elde etmek için 2 mg / mL sığır serum albümini (BSA) stok çözeltisini deiyonize H2O içinde aşağıdaki gibi seyreltin: 50 μL H2O / 50 μL BSA; 60 μL H2O / 40 μL BSA; 70 μL H2O / 30 μL BSA; 80 μL H2O/20 μL BSA; 90 μL H2O/10 μL BSA; 100 μL H2O
- 200 μL BCA reaktifi (Reaktif A ve reaktif B 50:1 oranında karıştırılır) ekleyerek reaksiyonu başlatın ve bir orbital çalkalayıcı (300 rpm) üzerinde hafif çalkalama altında karanlıkta 37 °C'de 1 saat inkübe edin. Bir plaka okuyucuda 560 nm'de absorbansı ölçün.
not: Numuneler tipik olarak μL başına 1 ila 1.5 μg protein içerir.
4. Yapay 4-Metilumbelliferil substratlar (4-MUG) ile enzim aktivitesi ölçümü
- 0.05 (α-galaktosidaz A için) veya 0.5 (asit α-glukozidaz için) μg protein/μL çözeltileri elde etmek için her numunenin ve pipetin hesaplanan miktarını taze 1.5 mL reaksiyon tüplerine seyreltin. Numuneleri tekrar 5 saniye vorteksleyin ve bu seyreltmenin 10 μL'sini 96 oyuklu bir plakaya pipetleyin (her numune iki kopya halinde).
- İlgili substrat çözeltisinden 20 μL ekleyerek reaksiyonu başlatın:
α-galaktosidaz A için: 0.06 M fosfat sitrat tamponunda 2 mM 4-Metilumbelliferil-α-D-galaktopiranosid (4-MU-gal), pH 4.7.
Asit α-glukozidaz için: 0.025 M sodyum asetat, pH 4.0 içinde 2 mM 4-metilumbelliferil α-D-glukopiranozit (4-MU-glu).
- Enzim reaksiyonlarını karanlıkta 37 ° C'de bir orbital çalkalayıcı (300 rpm) üzerinde hafif çalkalama altında 1 saat inkübe edin. 200 μL 1.0 M, pH 10.5 ayarlı glisin-NaOH tamponu ilavesiyle reaksiyonu sonlandırın.
- Aşağıdaki gibi 0.01 mg / mL'lik bir stoktan standart bir 4-metilumbelliferon (4-MU) eğrisi hazırlayın:
100 μL H2O/ hayır 4-MU; 80 μL H2O/ 20 μL 4-MU; 60 μL H2O / 40 μL 4-MU; 40 μL H2O / 60 μL 4-MU; 20 μL H2O / 80 μL 4-MU; H2O / 100 μL 4-MU yok, her seyreltmeden 10 μL'yi 96 oyuklu plakaya (iki katlar halinde) pipetleyin ve hacmi ve pH'ı ayarlamak için her bir oyuğa 200 μL 1.0 M glisin-NaOH tamponu ekleyin.
- Uygun filtre seti ile donatılmış bir floresan okuyucuda enzim aktivitesini ölçün ve floresan okuyucu cihazı için uygun yazılımı kullanarak verileri analiz edin.
not: Her iki 4-MUG substratı, α-galaktosidaz A veya asit α-glukozidaza maruz kalma sırasında 4-MU'ya indirgenir. Serbest bırakılan 4-MU, bir mikroplaka floresan okuyucu kullanılarak uyarma ve emisyon dalga boyları olarak sırasıyla 360 ve 465 nm'de ölçülebilen bir florokromdur.
