α-Galaktosidaz A ve Asit α-Glukozidaz Enzim Aktivitesinin İn Vitro Ölçümü

Özet

Kaynak: Lukas, J., et al. Fabry ve Pompe Hastalığında Farmakolojik Şaperon Duyarlılığını Test Etmek için İn Vitro Enzim Ölçümü. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, sentetik 4-Metilumbelliferil substratlar kullanılarak numunelerde α-galaktosidaz A ve asit α-glukozidaz için enzim aktivitesinin in vitro ölçümünü göstermektedir.

Protokol

1. Hücre Hasadı ve α-galaktosidaz A veya Asit α-glukozidaz Aktivitesi Ölçümü

1. Hücre hasadı
   1. Hasat gününde, hücreleri inkübatörden çıkarın ve ortamı aspire edin. Hücreleri PBS ile 2 kez Ca₂+ ve Mg₂ +
      dikkatlice yıkayın NOT: Bu adım kritiktir, çünkü DGJ ve DNJ sırasıyla α-galaktosidaz ve α-glukozidazın güçlü inhibitörleridir ve herhangi bir kalıntı testi geçersiz kılacaktır.
   2. Doğrudan hücrelerin üzerine 200 μL deiyonize su ekleyin. Hücreleri plakadan durulayın ve 1.5 mL'lik bir reaksiyon tüpüne aktarın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sodyum klorür	Merck, Darmstadt, Almanya	1,06,40,41,000
Potasyum klorür	Merck, Darmstadt, Almanya	1,04,93,60,500
MgCl2 x 6H2O	Merck, Darmstadt, Almanya	1,05,83,30,250
D (+) - Glikoz monohidrat	Merck, Darmstadt, Almanya	1,08,34,22,500
Sodyum Hidroksit	Merck, Darmstadt, Almanya	1,06,49,80,500
Sodyum asetat	Merck, Darmstadt, Almanya	1,06,26,40,050
HEK293H hücre hattı	Invitrogen, Karlsruhe, Almanya	11631-017
SafeSeal reaksiyon tüpleri, 1,5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Almanya	72.706
Tecan GENios Okuyucu	Tecan, Männedorf, İsviçre
Magellan veri analiz yazılımı v6.6	Tecan, Männedorf, İsviçre	N.A