$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Viral İnaktivasyon Testi
Not: Çeşitli virüsler için kuluçka süresi ve viral doz örnekleri Şekil 1A'da listelenmiştir. Virüsün daha yüksek konsantrasyonları, MOI/PFU'yu artırarak da test edilebilir.
- Huh-7.5 hücrelerini 96 oyuklu bir plakada (kuyucuk başına 1 × 104 hücre) tohumlayın ve tek tabakalı bir tabaka elde etmek için% 5 CO2 inkübatörü O / N'de 37 ° C'de inkübe edin.
- Test bileşiklerini veya kontrolleri inkübe edin (nihai konsantrasyonlar: CHLA = 50 μM; PUG = 50 μM; heparin = 1.000 μg/ml; DMSO = %1) 37 °C'de HCV partikülleri ile 1:1 oranında (Şekil 1A, 'Uzun Vadeli'). Örneğin, 1 x 104 FFU içeren 100 μl'lik bir virüs aşısına, 100 μL'lik bir 100 μM CHLA çalışma seyreltmesi ekleyin; bu, 50 μM'lik bir nihai konsantrasyonda CHLA muamelesi sağlar.
- Virüs-ilaç karışımını, test bileşiklerinin "alt terapötik" (etkisiz) konsantrasyonuna seyreltin. Örneğin, HCV'ye karşı etkisiz CHLA ve PUG konsantrasyonu 1 μM31'dir; bu nedenle, bu, 9.8 ml bazal ortam (% 2 FBS içeren hücre kültürü ortamı) ile gerçekleştirilebilen virüs-ilaç karışımının 50 kat seyreltilmesini gerektirir.
Not: Alt terapötik konsantrasyona seyreltme, test bileşikleri ile konakçı hücre yüzeyi arasındaki önemli etkileşimi önler ve hücresiz viryonlar üzerindeki tedavi etkisinin incelenmesine izin verir. Bu seyreltmenin, test bileşiklerinin belirli viral enfeksiyona karşı antiviral doz tepkisine bağlı olduğunu ve bu özel testin gerçekleştirilmesinden önce belirlendiğini unutmayın.
- Karşılaştırma için, virüsü test bileşikleri ile karıştırın ve enfeksiyondan önce hemen alt terapötik konsantrasyona seyreltin (kuluçka süresi yok) (Şekil 1A, 'Kısa Süreli').
- Huh-7.5 hücre tek tabakasına 100 μl seyreltilmiş HCV-ilaç karışımı ekleyin (virüs miktarı şimdi 1 x 102 FFU'dur; nihai MOI = 0.01) ve viral adsorpsiyona izin vermek için 37 ° C'de 3 saat inkübe edin.
- Enfeksiyonu takiben, seyreltilmiş inokula çıkarın ve kuyucukları iki kez 200 μl PBS ile nazikçe yıkayın.
not: Hücrelerin kaldırılmasını önlemek için yıkamaları nazikçe yapın.
- Her oyuğa 100 μl bazal ortam uygulayın ve 37 ° C'de 72 saat inkübe edin.
- Lusiferaz aktivitesi için süpernatanı test ederek ortaya çıkan enfeksiyonu analiz edin.
