Bir Viral İnaktivasyon Testi ile Bir Antiviral Test Bileşiğinin Etkinliğinin Değerlendirilmesi

1. Viral İnaktivasyon Testi

Not: Çeşitli virüsler için kuluçka süresi ve viral doz örnekleri Şekil 1A'da listelenmiştir. Virüsün daha yüksek konsantrasyonları, MOI/PFU'yu artırarak da test edilebilir.

1. Huh-7.5 hücrelerini 96 oyuklu bir plakada (kuyucuk başına 1 × 10⁴ hücre) tohumlayın ve tek tabakalı bir tabaka elde etmek için% 5 CO₂ inkübatörü O / N'de 37 ° C'de inkübe edin.
2. Test bileşiklerini veya kontrolleri inkübe edin (nihai konsantrasyonlar: CHLA = 50 μM; PUG = 50 μM; heparin = 1.000 μg/ml; DMSO = %1) 37 °C'de HCV partikülleri ile 1:1 oranında (Şekil 1A, 'Uzun Vadeli'). Örneğin, 1 x 104 FFU içeren 100 μl'lik bir virüs aşısına, 100 μL'lik bir 100 μM CHLA çalışma seyreltmesi ekleyin; bu, 50 μM'lik bir nihai konsantrasyonda CHLA muamelesi sağlar.
3. Virüs-ilaç karışımını, test bileşiklerinin "alt terapötik" (etkisiz) konsantrasyonuna seyreltin. Örneğin, HCV'ye karşı etkisiz CHLA ve PUG konsantrasyonu 1 μM31'dir; bu nedenle, bu, 9.8 ml bazal ortam (% 2 FBS içeren hücre kültürü ortamı) ile gerçekleştirilebilen virüs-ilaç karışımının 50 kat seyreltilmesini gerektirir.
   Not: Alt terapötik konsantrasyona seyreltme, test bileşikleri ile konakçı hücre yüzeyi arasındaki önemli etkileşimi önler ve hücresiz viryonlar üzerindeki tedavi etkisinin incelenmesine izin verir. Bu seyreltmenin, test bileşiklerinin belirli viral enfeksiyona karşı antiviral doz tepkisine bağlı olduğunu ve bu özel testin gerçekleştirilmesinden önce belirlendiğini unutmayın.
4. Karşılaştırma için, virüsü test bileşikleri ile karıştırın ve enfeksiyondan önce hemen alt terapötik konsantrasyona seyreltin (kuluçka süresi yok) (Şekil 1A, 'Kısa Süreli').
5. Huh-7.5 hücre tek tabakasına 100 μl seyreltilmiş HCV-ilaç karışımı ekleyin (virüs miktarı şimdi 1 x 10² FFU'dur; nihai MOI = 0.01) ve viral adsorpsiyona izin vermek için 37 ° C'de 3 saat inkübe edin.
6. Enfeksiyonu takiben, seyreltilmiş inokula çıkarın ve kuyucukları iki kez 200 μl PBS ile nazikçe yıkayın.
   not: Hücrelerin kaldırılmasını önlemek için yıkamaları nazikçe yapın.
7. Her oyuğa 100 μl bazal ortam uygulayın ve 37 ° C'de 72 saat inkübe edin.
8. Lusiferaz aktivitesi için süpernatanı test ederek ortaya çıkan enfeksiyonu analiz edin.

Şekil 1. Viral enfeksiyonların test bileşikleri CHLA ve PUG tarafından inaktivasyonu. Farklı virüsler, test bileşikleri ile uzun bir süre (titrasyondan önce 1.5 – 3 saat inkübe edildi; açık gri çubuklar) veya kısa bir süre (hemen seyreltilmiş; koyu gri çubuklar) 37 ° C'de alt terapötik konsantrasyona seyreltmeden önce ve ilgili konakçı hücreler üzerinde enfeksiyonun müteakip analizi. (A) Sağdaki tabloda her bir virüs için belirtilen nihai virüs konsantrasyonu (PFU/kuyucuk veya MOI), uzun süreli virüs-ilaç kuluçka süresi (i) ve müteakip kuluçka süresi (ii) ile deneyin şemaları (solda gösterilmiştir). (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV ve (F) RSV analizleri her ek panelde belirtilmiştir. Sonuçlar, virüs enfeksiyonu için DMSO negatif kontrol tedavisine karşı çizilmiştir ve gösterilen veriler, üç bağımsız deneyden elde edilen ortalamanın (SEM) standart hatalarını ± araçlardır. Bu rakam referanstan değiştirilmiştir.