Not: Hücre kültürü ve virüs enfeksiyonu ile ilgili tüm prosedürlerin, işlenen numunelerin biyogüvenlik seviyesine uygun sertifikalı biyogüvenlik başlıklarında yürütüldüğünden emin olun. Protokolleri açıklamak amacıyla, Gaussia lusiferase raportör etiketli HCV model virüs olarak kullanılır. Temsili sonuçlar bağlamında, kebulajik asit (CHLA) ve punicalagin (PUG) bileşikleri, erken viral giriş aşamaları sırasında hücre yüzeyi glikozaminoglikanları ile viral glikoprotein etkileşimlerini hedefleyen aday antiviraller olarak kullanılır. Birçok virüsün girişine müdahale ettiği bilinen heparin, böyle bir bağlamda pozitif kontrol tedavisi olarak kullanılmaktadır.
1. Hücre Kültürü, Bileşik Hazırlama ve Bileşik Sitotoksisite
- Analiz edilecek virüs enfeksiyon sistemi için ilgili hücre hattını büyütün (Tablo 1). HCV için,% 10 fetal sığır serumu (FBS), 200 U / ml penisilin G, 200 μg / ml streptomisin ve 0.5 μg / ml amfoterisin B ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM) Huh-7.5 hücrelerini büyütün.
- Test bileşiklerini ve kontrolleri kendi çözücülerini kullanarak hazırlayın: örneğin, CHLA ve PUG'u dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözün; heparini steril çift damıtılmış suda hazırlayın. Sonraki tüm seyreltmeler için kültür ortamını kullanın.
Not: Test bileşiği muamelelerindeki nihai DMSO konsantrasyonu deneylerde %1'den azdır; % 1 DMSO, karşılaştırma için tahlillere negatif kontrol tedavisi olarak dahil edilir.
- XTT (2,3-bis [2-metoksi-4-nitro-5-sülfofenil]-5-fenilamino)-karbonil]-2H-tetrazolyum hidroksit) gibi hücre canlılığını belirleyen reaktifi kullanarak viral enfeksiyon için hücreler üzerindeki test bileşiklerinin (örn., CHLA ve PUG) sitotoksisitesini belirleyin:
- HCV için, Huh-7.5 hücrelerini 96 oyuklu bir plakada (kuyucuk başına 1 × 104 hücre) tohumlayın ve tek tabakalı bir tabaka elde etmek için% 5 CO2 inkübatörü O / N'de 37 ° C'de inkübe edin.
- DMSO kontrolünü (% 1) veya test bileşikleri CHLA ve PUG'un artan konsantrasyonlarını (örn. 0, 10, 50, 100 ve 500 μM) üç nüsha halinde kültür kuyucuklarına uygulayın.
- 37 ° C'de 72 saat inkübe edin, ardından plakadaki ortamı atın ve hücreleri iki kez 200 μl fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
- Her bir oyuğa XTT bazlı in vitro toksikoloji test kitinden 100 μl tahlil çözeltisi ekleyin ve XTT formazan üretimine izin vermek için plakaları 37 ° C'de 3 saat daha inkübe edin.
- 492 nm'lik bir test dalga boyunda ve 690 nm'lik bir referans dalga boyunda bir mikroplaka okuyucu ile absorbansı belirleyin.
- Aşağıdaki formülü kullanarak hayatta kalan hücrelerin yüzdesini hesaplayın: hücre canlılığı (%) = At / As × %100, burada 'At' ve 'As' sırasıyla test bileşiklerinin absorbansını ve çözücü kontrolünü (örn. %1 DMSO) işlemlerini ifade eder. Üreticinin protokolüne göre GraphPad Prism gibi analitik bir yazılımdan test bileşiklerinin %50 hücresel sitotoksisite (CC50) konsantrasyonunu belirleyin.
2. Viral Enfeksiyonun Okunması
Not: Viral enfeksiyonun okunması, kullanılan virüs sistemine bağlıdır ve plak tahlilleri veya raportör etiketli virüslerden gelen raportör sinyallerinin ölçülmesi gibi yöntemleri içerebilir. Lusiferaz raportör aktivitesine dayalı olarak muhabir-HCV enfeksiyonunu tespit etme yöntemi aşağıda açıklanmıştır.
- Enfekte olmuş kuyulardan süpernatanları toplayın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca bir mikrosantrifüjde 17.000 x g'da berraklaştırın.
- Gaussia lusiferaz test kitinden 20 μl test süpernatanı ile 50 μl lusiferaz substratını karıştırın ve üreticinin talimatlarına göre doğrudan bir luminometre ile ölçün.
- Viral inhibisyonu (%) belirlemek için HCV enfektivitesini nispi ışık birimlerinin (RLU) log10'u olarak ifade edin ve üreticinin protokolüne göre GraphPad Prism yazılımından algoritmalar kullanarak HCV enfeksiyonuna karşı test bileşiklerinin %50 etkili konsantrasyonunu (EC 50) hesaplayın.
3. Viral Giriş/Füzyon Testi
Not: Çeşitli virüsler için kuluçka süreleri ve viral doz örnekleri Şekil 1A 'Giriş/Füzyon'da listelenmiştir. Virüsün daha yüksek konsantrasyonları, MOI/PFU'yu artırarak da test edilebilir.
- Huh-7.5 hücrelerini 96 oyuklu bir plakada (oyuk başına 1 × 104 hücre) tohumlayın ve tek tabaka elde etmek için% 5 CO2 inkübatörü O / N'de 37 ° C'de inkübe edin.
- Hücre tek katmanlarını plakalar halinde 4 °C'de 1 saat önceden soğutun.
- Hücreleri HCV (enfeksiyon çokluğu, MOI = 0.01) ile 4 ° C'de 3 saat boyunca enfekte edin. Örneğin, 1 x 102 odak oluşturma birimi (FFU) içeren 100 μl'lik bir virüs aşısı kullanın.
not: Viral aşının buz üzerine eklenmesini ve ardından gelen inkübasyonu 4 °C'lik bir buzdolabında gerçekleştirerek sıcaklığı 4 °C'de tutun, bu da viral bağlanmaya izin verir, ancak girişe izin vermez.
- Süpernatanı çıkarın ve hücre tek katmanlarını 200 μl buz gibi PBS ile iki kez nazikçe yıkayın.
not: Hücrelerin kaldırılmasını önlemek için yıkamaları nazikçe yapın.
- Kuyucukları test bileşikleri veya kontrolleri ile tedavi edin (nihai konsantrasyonlar: CHLA = 50 μM; PUG = 50 μM; heparin = 1.000 μg/ml; DMSO = %1) ve 37 ° C'de 3 saat inkübe edin. Örneğin, 90 μl ortama 10 μl 500 μM CHLA çalışma seyreltmesi ekleyin, karıştırın ve kuyucukları işleyin; bu, 50 μM.
'lik bir nihai konsantrasyonda CHLA muamelesi sağlar
not: 4 °C'den 37 °C'ye geçiş artık viral giriş/füzyon olayını kolaylaştırmakta ve bu nedenle test bileşiklerinin bu özel adım üzerindeki etkisinin değerlendirilmesine izin vermektedir.
- İlaç içeren süpernatanı aspire edin ve 200 μl sitrat tamponu (50 mM sodyum sitrat, 4 mM potasyum klorür, pH 3.0) veya PBS ile yıkayarak içselleştirilmemiş hücre dışı virüsleri uzaklaştırın. 37 ° C'de 72 saat inkübe etmeden önce 100 μl bazal ortam uygulayın.
- Ortaya çıkan enfeksiyonu, '2'de tarif edildiği gibi lusiferaz aktivitesi için süpernatanı test ederek analiz edin. Viral Enfeksiyonun Okunması'.
