Modifiye Turnusol Testi Kullanılarak Bakteriyel Bir Biyobelirteçin Kolorimetrik Tespiti

Özet

Kaynak: Tram, K., et al. Turnusol Testi Kullanarak Bakterilerin Kolorimetrik Tespiti. J. Vis. Exp. (2016).

Bu video, bir DNAzime'i aktive eden bir E. coli biyobelirteçini içeren, RNA bağlantısının bölünmesine ve bir DNAzime-üreaz konjugatının ayrılmasına yol açan bir kolorimetrik E. coli algılama yöntemini göstermektedir. Sonraki bir kolorimetrik test, amonyak kaynaklı pH değişiklikleri yoluyla E. coli biyobelirtecini tespit eder.

Protokol

1. E. coli Hücrelerinin Test için Hazırlanması

1. İstenen bir hücre süspansiyonu için, 1 ml kültürlenmiş stoğu 1.5 ml'lik bir mikrofüj tüpüne aktarın.
2. Hücreleri 6.000 x g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Hücre peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın.
3. Hücre peletine 10 μl reaksiyon tamponu ekleyin ve hücreleri yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca sonikleştirin. Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca bir buz kutusuna aktarın.
4. Hücre süspansiyonunu 5 dakika daha sonikleştirin.
5. Hücre süspansiyonunu 4 ° C'de 10 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüjleyin. Test için süpernatanı kullanın (10 μl).

2. Turnusol Testi

1. 1.5 ml'lik bir mikrofüj tüpünde, mikrofüj tüpüne 100 μl reaksiyon tamponu (RB) ekleyip girdaplayarak ve tamponu atarak tüpü önceden yıkayın.
2. 15 μl monte edilmiş EC1'i yıkanmış mikrofüj tüpüne aktarın.
3. Mikrofüj tüpünü manyetik bir rafa yerleştirerek manyetik boncukları yıkayın. Süpernatanı pipetleyerek çıkarın. Mikrofüj tüpünü raftan çıkarın, 100 μl RB ekleyin ve manyetik boncukları dikkatlice yeniden süspanse edin.
4. Adım 2.3'ü tekrarlayarak MB'yi iki kez daha yıkayın.
5. Mikrofüj tüpünü manyetik rafa geri yerleştirin, süpernatanı çıkarın ve adım 1.3'ten hazırlanan 10 μl E. coli örneğini ekleyin.
6. Mikrofüj tüpüne hafifçe vurarak numuneyi ve manyetik boncukları dikkatlice karıştırın.
7. Reaksiyonu oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
8. Reaksiyona 90 μl ddH₂O ekleyin ve mikrofüj tüpünü manyetik bir rafa yerleştirin.
9. Yaklaşık 3 dakikalık manyetik ayırmadan sonra, 85 μl süpernatanı dikkatlice 0,5 ml'lik bir mikrofüj tüpüne aktarın. Herhangi bir manyetik boncuk toplamaktan kaçınmak için süpernatanı yavaşça geri çekin.
10. Yukarıdaki mikrofüj tüpüne 15 μl %0.04 fenol kırmızısı ve 100 μl substrat çözeltisi ekleyin.
11. Renk değişimini kaydetmek için belirli zaman aralıklarında fotoğraf çekin.
    not: PH'daki değişiklik, mikroelektrotlu bir pH metre kullanılarak da izlenebilir. Başlangıç pH'ı yaklaşık 5.2-5.5 olmalıdır (çözelti sarıdır). Değilse, çözelti 1 mM Asetat Tamponu pH 5.0 ilavesiyle ayarlanabilir).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)	VWR AMRESCO	105
Sodyum Hidroksit (NaOH) peletleri	BIO BASIC KANADA A.Ş.	SB6789
Tris tabanı	VWR AMRESCO	497
üre	VWR AMRESCO	M123
Ksilenesyanol FF	SIGMA-ALDRICH	X-4126
% 0.04 Fenol kırmızısı	SIGMA-ALDRICH	P3532 Serisi
10x T4 polinükleotid kinaz reaksiyon tamponu	Lucigen (Lucigen)	30061-1
E. coli K12 (MG1655)	ATCC (Uzay Servisi)	ATCC700926
Manyetik Boncuk (BioMag)	Bangs Laboratuvarları A.Ş
Manyetik Ayırma Rafı	New England Biyo Laboratuvarları	S1506S
Mikrofuj tüpleri	Sarstedt	72,69
Hücre kültürü inkübatörü	Eppendorf Bilimsel	M13520000
Branson Ultrasonik temizleyici	Branson	Yok