Poxvirus ile Enfekte Hücrelerde Translasyon Regülasyonunu İncelemek İçin Bir Luciferase Reporter Testi

Özet

Kaynak: Dhungel, P., et al. Poxvirus ile Enfekte Hücrelerde Translasyon Regülasyonunu İncelemek için İn Vitro Transkribe RNA Tabanlı Lusiferaz Raportör Testi. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, poxvirus ile enfekte olmuş hücrelerde translasyon regülasyonunu incelemek için bir testi göstermektedir. Enfekte olmamış ve virüsle enfekte olmuş hücreler, ateşböceği lusiferaz (Fluc) ve Renilla lusiferaz (Rluc) kodlayan mRNA'larla birlikte transfekte edildi ve Fluc mRNA, 5' Poli(A) lider dizisi içeriyordu. Parçalanmış hücrelere biyolüminesan substratlar ekledikten sonra, lider dizi tarafından verilen virüs ile enfekte olmuş hücrelerde Fluc mRNA'nın translasyonel avantajını belirlemek için her iki lusiferazdan gelen sinyali ölçün.

Protokol

1. mRNA'yı Hücrelere Aktarın

1. HeLa hücrelerini 24 oyuklu bir plakada tohumlayın (ertesi gün yaklaşık ~% 80-90 birleşecek şekilde) ve% 5 CO₂ ile 37 ° C'de bir inkübatörde gece boyunca inkübe edin.
2. HeLa hücrelerini 5 Enfeksiyon Çokluğunda (MOI) vaccinia virüsü (VACV) ile enfekte edin veya enfekte olmamış HeLa hücrelerini karşılaştırma için saklayın.
   not: MOI, hücre başına düşen bulaşıcı viral partiküllerin sayısıdır.
3. MOI of X= {[(Hücre sayısı * X) / Virüs Titresi] * 1000} μl virüs, 1 mL ortamda.
4. İstenen h enfeksiyon sonrası (hpi) sonra (bu deneyde 10-12 hpi'de), Şekil 1C....

Sonuçlar

Şekil 1: mRNA sentezi ve transfeksiyonu. (A) İn vitro transkripsiyon şeması. İlgilenilen 5'-UTR'den aşağı akışta lusiferaz genini ve T7 promotörünü içeren PCR ile amplifiye edilen DNA, şablon olarak kullanılır. T7 RNA polimeraz, promotöre alınır ve 5' ila 3' yönünde beyaz olarak gösterilen ribonükleotidleri ekler. mRNA 25-30 nt uzunluğunda olduğunda, bir anti-ters başlık anal.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Corning 96 Kuyu Yarım Alan beyaz düz tabanlı polistiren mikroplaka	Corning	3693	Sağlam tabanlı opak duvarlı 96 kuyulu beyaz plaka
Çift Lusiferaz Raportör Test Sistemi	Promega	E1960	Çift Lusiferaz Test Kiti (DLAK)
GloMax Navigator Mikroplaka Luminometre	Promega	GM2010	Çok modlu plaka okuyucu luminometre olarak adlandırılır
Lipofektamin 2000	Thermo Fisher Bilimsel	11668019	Katyonik lipid transfeksiyon reaktifi
Opti-MEM	Thermo Fisher Bilimsel	31985070	Azaltılmış serum ortamı

adet Fuar Sertifikası Fuar Yılı