Poxvirus ile Enfekte Hücrelerde Translasyon Regülasyonunu İncelemek İçin Bir Luciferase Reporter Testi

Özet

Kaynak: Dhungel, P., et al. Poxvirus ile Enfekte Hücrelerde Translasyon Regülasyonunu İncelemek için İn Vitro Transkribe RNA Tabanlı Lusiferaz Raportör Testi. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, poxvirus ile enfekte olmuş hücrelerde translasyon regülasyonunu incelemek için bir testi göstermektedir. Enfekte olmamış ve virüsle enfekte olmuş hücreler, ateşböceği lusiferaz (Fluc) ve Renilla lusiferaz (Rluc) kodlayan mRNA'larla birlikte transfekte edildi ve Fluc mRNA, 5' Poli(A) lider dizisi içeriyordu. Parçalanmış hücrelere biyolüminesan substratlar ekledikten sonra, lider dizi tarafından verilen virüs ile enfekte olmuş hücrelerde Fluc mRNA'nın translasyonel avantajını belirlemek için her iki lusiferazdan gelen sinyali ölçün.

Protokol

1. mRNA'yı Hücrelere Aktarın

1. HeLa hücrelerini 24 oyuklu bir plakada tohumlayın (ertesi gün yaklaşık ~% 80-90 birleşecek şekilde) ve% 5 CO₂ ile 37 ° C'de bir inkübatörde gece boyunca inkübe edin.
2. HeLa hücrelerini 5 Enfeksiyon Çokluğunda (MOI) vaccinia virüsü (VACV) ile enfekte edin veya enfekte olmamış HeLa hücrelerini karşılaştırma için saklayın.
   not: MOI, hücre başına düşen bulaşıcı viral partiküllerin sayısıdır.
3. MOI of X= {[(Hücre sayısı * X) / Virüs Titresi] * 1000} μl virüs, 1 mL ortamda.
4. İstenen h enfeksiyon sonrası (hpi) sonra (bu deneyde 10-12 hpi'de), Şekil 1C'de gösterildiği gibi bir katyonik lipid transfeksiyon reaktifi kullanarak mRNA'yı (24 oyuklu plakaların oyuğu başına 500 ng toplam mRNA) transfekte edin.
   1. 24 oyuklu bir plakanın bir oyuğu için, bir mikrosantrifüj tüpünde ateşböceği lusiferaz (12A-Fluc) mRNA'sı taşıyan 480 ng 12A dizisi ve Renilla lusiferaz (Kozak-Rluc) mRNA'sı taşıyan 20 ng Kozak dizisi karıştırın. Başka bir mikrosantrifüj tüpünde 1.1 μL katyonik lipid transfeksiyon reaktifi ekleyin.
   2. Her iki tüpe de 55 μL indirgenmiş serum ortamı ekleyin. Karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
   3. 5 dakikalık inkübasyondan sonra, mRNA mRNA içeren tüpe indirgenmiş serum ortamı içeren 55 μL katyonik lipid transfeksiyon reaktifi ekleyin.
   4. Nazikçe ama iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
   5. İnkübasyon sırasında, hücre kültürü ortamını çıkarın ve 24 oyuklu plakaların oyuğu başına 400 μL indirgenmiş serum ortamı ekleyin.
   6. İnkübasyondan sonra, karışımın 100 μL'sini damla damla ve eşit bir şekilde 24 oyuklu plakalardan oluşan bir oyuğa ekleyin.

2. Luciferaz Aktivitelerini Ölçün

1. 12A-Fluc ve Kozak-Rluc mRNA'nın birlikte transfeksiyonundan beş saat sonra, iki raportör testi gerçekleştirebilen bir lusiferaz test sistemi kullanarak lusiferaz aktivitesini ölçün (ör., Çift Lusiferaz Raportör test kiti).
2. İndirgenmiş serum ortamını çıkarın ve lusiferaz tahlil kitinin bir bileşeni olan 150 μL 1x lizis tamponu ekleyerek hücreleri parçalayın.
3. Oda sıcaklığında 10 dakikalık inkübasyondan sonra, hücreleri hurdaya çıkararak lizatı toplayın ve bunları bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
4. Lizatı 12.000 x g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca pelet hücresi kalıntılarına santrifüjleyin.
5. Sağlam bir tabana sahip opak duvarlı 96 oyuklu beyaz bir tahlil plakasına 30 μL süpernatan ekleyin.
6. Lusiferaz test kitini ve çok modlu bir plaka okuyucu luminometresini kullanarak çift lüminesansı ölçün.
7. Tablo 1. not: Okuma, manuel bir luminometre kullanılarak da alınabilir. Bir küvette Fluc için eşit hacimde lizat ve substrat ekleyin. 2 saniye bekleyin ve bir luminometre kullanarak 10 saniye ölçün. Fluc ölçümünü takiben, küveti luminometreden hızlı bir şekilde çıkarın ve Rluc için manuel olarak eşit hacimde alt tabaka ekleyin. Yine 2 saniye bekleyin ve bir luminometre kullanarak 10 saniye ölçün.
8. Lüminesans okuma verilerini istenen bir dosya formatına aktarın.
9. Fluc değerini iç kontrol Rluc değerine bölerek enfekte olmamış ve VACV ile enfekte olmuş HeLa hücrelerinde 12A-Fluc mRNA'dan nispi translasyon oranını belirleyin.
   NOT: Şekil 2, göreceli Fluc aktivitesi elde etmek için ham verilerin adım adım analizini göstermektedir.

Tablo 1: Lusiferaz Ölçüm Ayarları – önerilen hacim veya süre ile lusiferaz ölçümü için adımlar.

Adım -ları	Hacim/Zaman
Lusiferaz Test Substratını (Fluc) Enjekte Edin:	30 μL
Bekleme / Kuluçka süresi:	2 saniye
Lüminesans Ölçümü (Fluc):	10 saniye
Stop & Glo Substrat (Rluc):	30 μL
Bekleme / Kuluçka süresi:	2 saniye
Lüminesans Ölçümü (Rluc):	10 saniye

Sonuçlar

Şekil 1: mRNA sentezi ve transfeksiyonu. (A) İn vitro transkripsiyon şeması. İlgilenilen 5'-UTR'den aşağı akışta lusiferaz genini ve T7 promotörünü içeren PCR ile amplifiye edilen DNA, şablon olarak kullanılır. T7 RNA polimeraz, promotöre alınır ve 5' ila 3' yönünde beyaz olarak gösterilen ribonükleotidleri ekler. mRNA 25-30 nt uzunluğunda olduğunda, bir anti-ters başlık anal...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Corning 96 Kuyu Yarım Alan beyaz düz tabanlı polistiren mikroplaka	Corning	3693	Sağlam tabanlı opak duvarlı 96 kuyulu beyaz plaka
Çift Lusiferaz Raportör Test Sistemi	Promega	E1960	Çift Lusiferaz Test Kiti (DLAK)
GloMax Navigator Mikroplaka Luminometre	Promega	GM2010	Çok modlu plaka okuyucu luminometre olarak adlandırılır
Lipofektamin 2000	Thermo Fisher Bilimsel	11668019	Katyonik lipid transfeksiyon reaktifi
Opti-MEM	Thermo Fisher Bilimsel	31985070	Azaltılmış serum ortamı

adet Fuar Sertifikası Fuar Yılı