Bir Antibiyotiğin Minimum İnhibitör Konsantrasyonunu Değerlendirmek için Bir Mikrotitre Plaka Yöntemi

Özet

Kaynak: Ketelboeter, L. M., et al. Bakteriyel Piyomelanin Üretimini İnhibe Etme ve Oksidatif Strese Duyarlılıkta Karşılık Gelen Artışı Belirleme Yöntemleri. J. Vis. Exp. (2015).

Bu video, bakterilere karşı test antibiyotiklerinin Minimum İnhibitör Konsantrasyonunu (MIC) belirlemek için mikrotitre plakası tabanlı bir yöntemi göstermektedir. Bir test antibiyotiğinin seri dilüsyonlarını içeren bir mikrotitre plakasına bakteriyel patojen Pseudomonas aeruginosa'nın bir süspansiyonu ve bakteriler tarafından pyomelanin üretiminin bir inhibitörü eklendikten sonra, oyukların optik yoğunluğu, antibiyotiğin minimum inhibitör konsantrasyonunu ve piyomelanin üretim inhibitörünün bakterinin antibiyotik duyarlılığını inhibe eden etkisini hesaplamak için ölçülür.

Protokol

1. 96 oyuklu Plakalarda Antibiyotik Minimum İnhibitör Konsantrasyonu (MIC) Testi

1. NTBC (2- [2-nitro-4- (triflorometil) benzoil] -1,3-sikloheksandion) ile ve NTBC olmadan LB'de (Luria-Bertani) test edilecek suşların gece kültürlerini ayarlayın.
   not: Bu protokol, 300 μM NTBC'nin temsili seviyesi kullanılarak tarif edilir.
   1. 2 ml LB'ye 300 μM NTBC ekleyin. NTBC olmaması durumunda 2 ml LB'ye eşdeğer hacimde bir araç (Dimetil sülfoksit, DMSO) ekleyin.
   2. Steril kürdan kullanarak, tüpleri izole edilmiş bir bakteri kolonisi ile aşılayın. Her suş için NTBC'li bir kültür ve NTBC'siz bir kültür olacaktır. Bir hava inkübatöründe bir doku kültürü döndürücüsü kullanarak havalandırma ile 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
2. Ertesi gün, MIC testini ayarlamak için LB + NTBC ve LB + DMSO ana çözümlerini yapın. NTBC'yi 600 μM'lik bir konsantrasyonda ekleyin, çünkü bu, aşılama eklendiğinde iki kat seyreltilecek ve 300 μM'lik bir nihai konsantrasyon elde edilecektir.
   1. Bir suş için bir antibiyotiği test etmek için, 2 ml LB'ye 600 μM NTBC ekleyin ve NTBC ana çözeltisini yapmak için karıştırın. 2 ml LB'ye eşdeğer bir araç hacmi (DMSO) ekleyin ve NTBC ana çözeltisini elde etmek için karıştırın. Bu çözeltileri, antibiyotik stok çözeltileri oluşturmak ve ayrıca 96 oyuklu plakalarda seyreltme serisini ayarlamak için kullanın.
      not: Ana çözelti formülasyonları, pipetleme hatalarını hesaba katmak için ekstra çözeltiler sağlayacaktır. Ana çözeltiler, test edilen antibiyotik ve suş sayısına bağlı olarak gerektiği gibi büyütülebilir veya küçültülebilir.
3. Antibiyotik solüsyonlarını LB + NTBC veya LB + DMSO master solüsyonlarında hazırlayın.
   not: Bu çözeltilerdeki antibiyotik konsantrasyonu, istenen nihai konsantrasyonun iki katı olmalıdır. 100 μl'yi 96 oyuklu bir plakada dört kuyucuğa aktarmak için yeterli çözelti yapılmalıdır.
   1. Gentamisin +/- NTBC stok çözeltisini 64 μg / ml'de hazırlayın. Bu çözeltiyi yapmak için, 450 μl LB + NTBC veya LB + DMSO ana çözeltisine 0.288 μl gentamisin stoğu (100 mg / ml) ekleyin.
      NOT: Pseudomonas aeruginosa PAO1 için maksimum gentamisin konsantrasyonu 32 μg/ml'dir.
   2. Kanamisin +/- NTBC stok çözeltisini 256 μg/ml'de yapın. Bu çözeltiyi yapmak için, 450 μl LB + NTBC veya LB + DMSO ana çözeltilerine 3.84 μl kanamisin stoğu (30 mg / ml) ekleyin.
      not: P. aeruginosa PAO1 için maksimum kanamisin konsantrasyonu 128 μg/ml'dir.
   3. 8 μg / ml'de tobramisin +/- NTBC stok çözeltisini hazırlayın. Bu çözeltiyi yapmak için, 450 μl LB + NTBC veya LB + DMSO ana çözeltilerine 0.36 μl tobramisin stoğu (10 mg / ml) ekleyin.
      not: P. aeruginosa PAO1 için maksimum tobramisin konsantrasyonu 4 μg/ml'dir.
      not: Antibiyotikler ve konsantrasyonlar, test edilecek bakteriler için ayarlanabilir.
4. 96 oyuklu bir plakadaki dört oyuğa her 2x antibiyotik çözeltisinden 100 μl ekleyin. Bu çözümleri A satırına yerleştirin. Örneğin, gentamisin A1'den A4'e, kanamisin A5'ten A8'e ve tobramisin A9'dan A12'ye yerleştirilmelidir. 96 oyuklu bir plaka kurulumunun diyagramı için Şekil 1A'ya bakın.
   not: Bir plakada birden fazla antibiyotik test edilebilir, ancak diğer suşlardan çapraz kontaminasyon potansiyelini ortadan kaldırmak için plaka başına yalnızca bir suş test edilmelidir.
5. 96 oyuklu plakanın B'den H'ye kadar olan sıralarına 50 μl LB + NTBC veya LB + DMSO ana çözeltisi ekleyin. Bir plakanın LB + NTBC ve bir plakanın LB + DMSO olduğundan emin olun. Şekil 1A'ya bakın.
   1. LB + NTBC'deki antibiyotikler için LB + NTBC kullanın. LB + DMSO'daki antibiyotikler için LB + DMSO kullanın.
6. Bir mikro pipetör kullanarak, 50 μl çözeltiyi A satırından B satırına aktararak antibiyotiklerin iki kat seri seyreltmelerini gerçekleştirin. Çözeltiyi karıştırın, pipet uçlarını değiştirin ve çözeltinin 50 μl'sini B satırından C satırına aktarın. Kalan satırlar için tekrarlayın. G sırasını seyrelttikten sonra, o sıradan 50 μl çözeltiyi çıkarın ve atın. Bakteri üremesi için antibiyotiksiz kontrol olarak H satırını kullanın. Bkz. Şekil 1B.
   NOT: A'dan G'ye kadar olan sıralardaki her kuyucuk, istenen nihai konsantrasyonun 2 katında LB + NTBC veya LB + DMSO'da 50 μl antibiyotik içerir. H satırı, antibiyotik içermeyen LB + NTBC veya LB + DMSO içerir.
7. Gece boyunca alınan kültürlerin OD_600'ünü ölçün. Ortamda bulunan pyomelanini ortadan kaldırmak için OD₆₀₀ okumalarını almadan önce tüm kültürleri yıkayın.
   1. Kültürleri, 1 ml kültürü 16.000 x g'da 2 dakika boyunca bir mikrosantrifüjde santrifüjleyerek yıkayın. Süpernatanı bir mikro pipetleyici ile çıkarın ve hücre peletini 1 ml LB içinde yeniden süspanse edin.
8. Gece boyunca kültürleri LB.
   içinde 2.75x10⁵ CFU / ml'ye seyreltin not: Bir OD₆₀₀ ünitesinin P. aeruginosa için 1x10⁹ CFU/ml'ye eşdeğer olduğunu varsayalım. OD'den CFU/ml'ye dönüşümler diğer bakterilerde farklı olabilir.
9. Uygun kuyucuğa 50 μl seyreltilmiş bakteri kültürü ekleyin.
   not: NTBC'de yetiştirilen kültürler NTBC içeren kuyucuklara, DMSO'da yetiştirilen kültürler ise DMSO içeren kuyucuklara eklenmelidir. Şekil 1B'ye bakın.
   1. Her suş ve antibiyotik konsantrasyonu için üç oyuğa bakteri ekleyin. Bakteriyel kontaminasyonu kontrol etmek için dördüncü kuyucuğa 50 μl LB ekleyin. Şekil 1B'ye bakın.
   2. Kuyuları aşılamak için çok kanallı bir mikro pipetleyici kullanın. Komşu kuyuların kirlenmesini önlemek için aşı eklerken pipet uçlarının kuyucukların dibine yakın olduğundan emin olun.
      not: Kuyucuklara bakteri kültürü eklemek, antibiyotik ve NTBC konsantrasyonlarını iki kat seyreltecektir.
10. 96 oyuklu plakaları parafilm ile örtün ve 37 ° C'de yaklaşık 24 saat inkübe edin. 96 oyuklu plakaları bir hava inkübatöründe statik olarak inkübe edin.
11. Kuyucuklarda bakteri üremesi için plakaları inceleyin. MIC, her bir suşun üç kopyası için de bakteri üremesinin görülmediği en düşük antibiyotik konsantrasyonudur.
    1. Plakayı büyüme açısından görsel olarak inceleyin veya OD_600'e ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak okuyun.

Sonuçlar

Şekil 1: Antibiyotik MIC testinin şeması 96 oyuklu plaka kurulumu. (A) En yüksek başlangıç konsantrasyonuna sahip 100 μl 2x antibiyotik A satırındadır. B'den H'ye kadar olan sıralar, antibiyotiksiz 50 μl LB + NTBC veya LB + DMSO ile doldurulur. (B) A'dan G'ye kadar olan sıralarda iki katlı seri seyreltmeler gerçekleştirilir, bu da her bir oyukta isten...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2-[2-nitro-4- (triflorometil) benzoil]-1,3-sikloheksandion (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269-50mg	Nitisinone olarak da adlandırılır. DMSO'da çözünür.
H2O2	Sigma-Aldrich	216763-100ML	Ağırlıkça 30 % H2O. Stabilize.
Gentamisin	Altın Biyografi	G-400-100	H2O'de çözünür Filtre sterilize edilir.
Kanamisin	Balıkçı Bilimsel	BP906-5	H2O'de çözünür Filtre sterilize edilir.
Tobramisin	Sigma-Aldrich	T4014-100MG	H2O'de çözünür Filtre sterilize edilir.