1. Çok Kuyulu Plakalar Üzerinde İnce İki Katmanlı Poliakrilamid (PA) Hidrojellerin İmalatı
- Poliakrilamid hidrojel üretimi
not: Şekil 1'e bakın.
- 0,6 kPa ila 70 kPa arasında değişen ayarlanabilir sertliğe sahip hidrojeller üretmek için %3 - 10 %40 stok akrilamid çözeltisi (bkz. Malzeme Tablosu) ve %0.06 - 0.6 %2 stok bis-akrilamid çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) içeren sulu çözeltiler hazırlayın. Tablo 1'e bakın.
- 0.6 kPa hidrojeller için %3 akrilamid ile %0.045 bis-akrilamid karıştırın. 3 kPa hidrojeller için %5 akrilamid ile %0.074 bis-akrilamid karıştırın. 10 kPa hidrojeller için %10 akrilamid ile %0.075 bis-akrilamid karıştırın. 20 kPa hidrojeller için %8 akrilamid ile %0.195 bis-akrilamid karıştırın. 70 kPa hidrojeller için %10 akrilamid ile %0.45 bis-akrilamid karıştırın.
NOT: İstenen PA hidrojel sertliğinin elde edilmesiyle ilgili daha fazla ayrıntı başka bir yerde bulunabilir.
- İstenen her hidrojel sertliği için iki sulu çözelti hazırlayın. Çözelti 1'i boncuksuz olacak şekilde ve Çözelti 2'yi %0,03 0,1 μm çapında floresan mikro boncuklar içerecek şekilde hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Çözeltilerin polimerizasyonunu engellediği bilinen oksijeni ortadan kaldırmak için Çözelti 1 ve 2'yi 15 dakika vakumla degazdan arındırın.
- Bir polimerizasyonun başlatılmasını sağlamak için Çözelti 1'e 10 g / mL stok APS çözeltisinin% 0.6'sını ve% 0.43 tetrametiletildiamin (TEMED) ekleyin. Hızlı hareket edin.
- 24 oyuklu çanağın her bir oyuğunun ortasına 3,6 μL Çözelti 1 ekleyin.
- Kuyucukları hemen 12 mm işlenmemiş dairesel lamellerle örtün ve Çözelti 1'in tamamen polimerize olması için 20 dakika bekletin.
- Lamellerin çıkarılmasını kolaylaştırmak için ucunda küçük bir kanca oluşturmak için bir şırınga iğnesini bir yüzeye hafifçe vurun. Şırınga iğnesini kullanarak lamelleri kaldırın.
- 10 g/mL stok APS çözeltisinin %0,6'sını ve Çözüm 2'ye %0,43 TEMED ekleyin. 24 oyuklu tabağın her bir oyuğunda ilk katmanın üzerine 2,4 μL karışım biriktirin.
- Çözelti 2'yi 12 mm dairesel cam lamellerle örtün, ikinci katmanın kalınlığının minimum olmasını sağlamak için bir çift forseps kullanarak hafifçe aşağı doğru bastırın. Çözelti 2'nin 20 dakika polimerize olmasına izin verin.
- Kuyucukların her birine 500 μL 50 mM HEPES pH 7.5 ekleyin ve ardından cam lamelleri şırınga iğnesi ve forseps ile çıkarın.
- Poliakrilamid hidrojellerin sterilizasyonu, kollajen kaplaması ve dengelenmesi
- Sterilizasyona izin vermek için hidrojelleri doku kültürü başlığında 1 saat UV'ye maruz bırakın.
- % 1 DMSO ve 50 mM HEPES pH = 7.5'te% 0.5 ağırlık / hacim sülfosüksinimidil 6- (4 "-azido-2" -nitrofenilamino) heksanoat (Sülfo-SANPAH, Malzeme Tablosuna bakınız) karışımı hazırlayın.
- Bu çözeltiden 200 μL'yi hidrojellerin üst yüzeyine ekleyin. Hızlı hareket ederek, onları etkinleştirmek için 10 dakika boyunca UV'ye (302 nm) maruz bırakın.
- Hidrojelleri 1 mL 50 mM HEPES pH = 7.5 ile iki kez yıkayın. Fazla çapraz bağlayıcının çıkarıldığından emin olmak için gerekirse tekrarlayın.
- Hidrojelleri 50 mM HEPES içinde 200 μL 0.25 mg / mL sıçan kuyruğu Kollajen I (Malzeme Tablosuna bakınız) ile protein kaplayın. Hidrojelleri, kollajen çözeltisi üstte olacak şekilde gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
not: Dehidrasyonu/buharlaşmayı önlemek için, çok kuyulu plakaları ikincil bir muhafazaya yerleştirin ve muhafazanın iç çevresine suya batırılmış laboratuvar temizleme dokularını ekleyin.
- Hidrojellerin kalınlığını ölçmek için 40X objektifli bir epifloresan veya konfokal mikroskop kullanın. Bunu, hidrojelin alt (cam yüzeyin olduğu yer) ve üst düzlemlerinin (floresan boncukların yoğunluğunun maksimum olduğu yer) z konumlarını bularak yapın. Ardından yüksekliği belirlemek için z konumlarını çıkarın.
not: Hidrojellerin kalınlığını ölçmek için ters çevrilmiş bir epifloresan mikroskobu ve sayısal açıklığı 0.65 olan bir 40X objektif kullandık. Hidrojellerin tam sertliğini doğrulamak için bu noktada Atomik Kuvvet Mikroskobu ölçümleri (AFM) de yapılabilir (bkz. Şekil 2).
- İlgilenilen hücreleri hidrojeller üzerine tohumlamadan önce, hidrojellerin üzerine 1 mL ortam ekleyin ve dengeyi sağlamak için 37 °C'de 30 dakika ila 1 saat inkübe edin.
not: MCDB-131 tam ortamını ekledik çünkü bu, model konak hücrelerinin (HMEC-1) kültürlendiği ortamdır (ayrıntılar için bkz. adım 2.1).
2. İnsan Mikrovasküler Endotel Hücre Kültürü ve Hidrojeller Üzerinde Tohumlama
- % 10 fetal sığır serumu, 10 ng / mL epidermal büyüme faktörü, 1 μg / mL hidrokortizon ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş MCDB-131 ortamı içeren MCDB-131 tam ortamında HMEC-1 (insan, mikrovasküler endotelyal) hücrelerinin kültürü (bkz.
- Birleşen kültürleri her 3-4 günde bir 1: 6'ya bölün ve hücreleri 40. geçişe kadar tutun.
- Deneyden bir gün önce,% 0.25 tripsin / EDTA kullanarak hücreleri kültür kaplarından ayırın. Önce hücreleri ve kültür kabını 1x steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve ardından uygun miktarda% 0.25 tripsin / EDTA (100 mm'lik tabak veya 75 cm'lik şişe başına 2 mL, 60 mm'lik tabak veya 25 cm'lik şişe başına 1 mL) ekleyin, hücrelerin substratlarından ayrılmasına izin vermek için şişeyi 37 ° C'de 5-10 dakika inkübe edin.
- İstenilen hacimde MCDB-131 tam ortam ekleyerek tripsini nötralize edin, hücre kümelerini parçalamak için hafifçe pipetleyin ve ardından çözeltiyi konik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
- Hücrelerin eşit olarak dağıldığından emin olmak için hücre çözeltisini hafifçe döndürün ve ardından çözeltiden 20 μL çıkarın ve bir cam hemositometrenin lamel altındaki iki odayı çok nazikçe doldurun.
- Konik santrifüj tüpünde bulunan hücre çözeltisini, 500 x g'da 10 dakika santrifüjleme kullanarak aşağı doğru peletleyin.
- 10 dakikalık bekleme süresi boyunca, bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Bir mikroskop kullanın, 10X objektifle hemositometrenin ızgara çizgilerine odaklanın ve ardından 1 mm x 1 mm'lik bir karedeki hücre sayısını saymak için bir el çetele sayacı kullanın.
- Hemositometreyi 1 mm x 1 mm kareye taşıyın, oradaki hücreleri sayın ve işlemi iki kez daha tekrarlayın. Dört ölçümün ortalamasını hesaplayın ve ardından ortalamayı 104 ile çarpın. Nihai değer, santrifüjlenmekte olan hücre süspansiyonundaki canlı hücrelerin / mL'nin sayısıdır.
- Hücre peletinin bozulmamasını sağlarken sıvıyı konik santrifüj tüpünden çıkarın. MCDB-131 tam ortamındaki hücreleri 4 x 105 hücre / mL konsantrasyonda yeniden süspanse edin.
- Önce hidrojellerin inkübe edildiği ortamı çıkararak ve ardından her bir hidrojel üzerine 1 mL hücre süspansiyonu ekleyerek hidrojeller üzerinde süspansiyon halindeki hücreleri tohumlayın.
3. İnsan Mikrovasküler Endotel Hücrelerinin L. monocytogenes ile Enfeksiyonu
- Enfeksiyondan üç gün önce, kullanılacak Lm suşunu bir gliserol stoğundan (-80 ° C'de saklanır) 7.5 μg / mL kloramfenikol ve uygunsa 200 μg / mL streptomisin içeren bir BHI-agar plakasına çizin.
not: Çizgilenecek suş, yapısal olarak floresan eksprese eden (immün boyama için JAT1045 kullanıldı) veya ActA promotörü altında floresan eksprese eden (akış sitometrisi veya çekiş kuvveti mikroskobu için JAT983 veya JAT985 kullanıldı) vahşi tip veya mutant olabilir.
- Ayrı koloniler oluşana kadar (1-2 gün) plakaları 37 ° C'de inkübe edin.
- Enfeksiyondan bir gün önce, istenen suşu gece boyunca büyütün, BHI ortamında 7.5 μg / mL kloramfenikol (uygunsa) ile 30 ° C'de 150 rpm'de çalkalayın.
- 5 mL BHI ortamını 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne yerleştirin, 7.5 μg/mL kloramfenikol (uygunsa) ekleyin ve ardından steril 10 μL'lik bir uç kullanarak agar plakasından tek bir koloniyi aşılayın.
- Ertesi gün, enfeksiyondan hemen önce, bakteri çözeltisinin optik yoğunluğunu 600 nm'de (OD600) numuneyi 1: 5 oranında seyrelterek ölçün; boşluk olarak hizmet etmek için tek başına BHI içeren bir küvet kullanın.
- Gece boyunca kültürü 0.1'lik bir OD600'e seyreltin ve bakterilerin log faz büyümesine ulaşmasını sağlamak için BHI ortamında 7.5 μg / mL kloramfenikol (uygunsa) ile 30 ° C'de 2 saat çalkalayarak inkübe edin.
- 0,2 - 0,3 civarında olması beklenen bakteri çözeltisinin OD600'ünü ölçün. OD600 daha yüksekse, yalnızca BHI ile 0,2 - 0,3'e seyreltin.
- 1 mL bakteri çözeltisini bir mikrosantrifüj tüpüne alın. Oda sıcaklığında santrifüjleme kullanarak 2.000 x g'da 4 dakika döndürün. Süpernatanı çıkarın ve bakteri peletini doku kültürü başlığında 1 mL doku kültürü dereceli PBS'de yeniden süspanse edin. Bakterileri oda sıcaklığında 2.000 x g'da 4 dakika döndürerek iki kez daha yıkayın. Süpernatanı çıkarın ve bakterileri 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin.
- PBS'de yeniden süspanse edilen 10 veya 50 μL bakteriyi 1 mL MCDB-131 tam ortam ile karıştırarak enfeksiyon karışımını hazırlayın ve çok sayıda enfeksiyon için (MOI; yani, konak hücre başına bakteri sayısı) konak hücre başına yaklaşık 50 bakteri veya konak hücre başına 10 bakteri.
- Hidrojelleri veya hücreleri bozmamaya dikkat ederek ortamı 24 oyuklu plakaların kuyularından çıkarın. Hücreleri 1 mL MCDB-131 tam ortam ile 1x yıkayın ve ardından her oyuğa 1 mL bakteri ekleyin.
- Plakayı kapağıyla örtün ve sızıntıyı önlemek için plakaları polietilen gıda sargısı ile sarın. Plakaları santrifüje yerleştirin ve istilayı senkronize etmek için numuneleri 200 x g'da 10 dakika döndürün. Plakaları doku kültürü inkübatörüne taşıyın ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
- Numuneleri MCDB-131 tam besiyeri ile 4 kez yıkayın ve doku kültürü inkübatörüne taşıyın. 30 dakika daha sonra, ortamı 20 μg / mL gentamisin ile desteklenmiş ortamla değiştirin.
4. Konak Hücrelerinin Enfeksiyona Bağlı Duyarlılığını Hücre Dışı Matriks Sertliğini Ölçmek için Akış Sitometrisi
- 5 mg kollajenaz tartın ve 15 mL'lik konik santrifüj tüpüne yerleştirin. 10 mL% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve iyice karıştırın.
- Enfeksiyondan 8 saat sonra, ortamı 24 oyuklu plakanın kuyucuklarından çıkarın ve kuyucukları 1x doku kültürü PBS ile yıkayın. PBS'yi kuyucuklardan çıkarın ve her oyuğa 200 μL tripsin-EDTA / kollajenaz karışımı ekleyin. Hücrelerin tamamen ayrılmasını sağlamak için bunu 10 dakika boyunca doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.
- Her kuyucuk için yeni bir pipet kullanın ve karışımı 8 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücrelere zarar vermemek için nazik olun. Tripsini nötralize etmek için her oyuğa 200 μL tam ortam ekleyin.
- Her bir oyuğun 400 μL'lik hücre çözeltisini, 35 μm'lik bir hücre süzgeci kapağına sahip 5 mL'lik bir polistiren tüpe aktarın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Akış sitometrisi ile numune başına 10.000 - 20.000 hücreyi analiz edin. Akış sitometrisi yoluyla veri toplama gerçekleştirin ve ticari olarak mevcut ilgili yazılımı kullanarak kuyu başına enfekte olmuş hücrelerin yüzdesini belirleyin. Hücre sayılarının dağılımının büyük kısmını geçitlemek için ileri dağılım ve yan dağılım grafiklerini kullanın.
NOT:: Bu, tek hücrelerin analizini sağlayacak ve kalıntıları veya hücre çiftlerini veya üçlülerini ortadan kaldıracaktır.
- Kontrol ile enfekte olmamış hücrelerden gelen floresan sinyalini ölçün ve otofloresan hariç enfekte olmuş hücrelerin popülasyonunu kapatın.
Tablo 1. Değişen sertliğe sahip poliakrilamid (PA) hidrojellerin bileşimi. Bu tabloda, belirli bir sertliği (Young modülü, E) elde etmek için stok %40 akrilamid çözeltisi yüzdesi ve stok %2 bis-akrilamid çözeltisi yüzdesi farklı sütunlarda belirtilmiştir.
| Young modülü (E, kPa) | Akrilamid % (%40 stoktan) | Bisakrilamid % (%2 stoktan) |
| 0,6 | 3 | 0,045 |
| 3 | 5 | 0,075 |
| 10 | 10 | 0,075 |
| 20 | 8 | 0,195 |
| 70 | 10 | 0,45 |
