$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Çok Kuyulu Plakalar Üzerinde İnce İki Katmanlı Poliakrilamid (PA) Hidrojellerin İmalatı
- 10 g/mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için amonyum persülfatı (APS) damıtılmış ultra saf suda çözün. Solüsyonu ayırın ve kısa süreli kullanım için (3 hafta) 4 ° C'de saklayın.
NOT: Yukarıdaki çözelti, hidrojel imalatından önce hazırlanabilir.
- 24 kuyulu bulaşıkların cam aktivasyonu
- 24 oyuklu cam alt plakaları 13 mm çapında oyuklarla (Malzeme Tablosuna bakınız) oda sıcaklığında oyuk başına 500 μL 2 M sodyum hidroksit (NaOH) ile 1 saat inkübe edin.
- Kuyuları 1x ultra saf suyla durulayın ve ardından her bir kuyucuğa 5 dakika boyunca %95 etanol içinde 500 μL %2 (3-Aminopropil) trietoksisilan (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
- Kuyuları 1 kez tekrar suyla durulayın ve her kuyucuğa 30 dakika boyunca 500 μL% 0.5 glutaraldehit ekleyin. Kuyuları 1 kez suyla durulayın ve kapağı kapalı olarak 60 °C'de kurutun.
- Poliakrilamid hidrojel üretimi
NOT: Şekil 1'e bakın.
- 0,6 kPa ila 70 kPa arasında değişen ayarlanabilir sertliğe sahip hidrojeller üretmek için %3 - 10 %40 stok akrilamid çözeltisi (bkz. Malzeme Tablosu) ve %0.06 - 0.6 %2 stok bis-akrilamid çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) içeren sulu çözeltiler hazırlayın. Tablo 1'e bakın.
- 0.6 kPa hidrojeller için %3 akrilamid ile %0.045 bis-akrilamid karıştırın. 3 kPa hidrojeller için %5 akrilamid ile %0.074 bis-akrilamid karıştırın. 10 kPa hidrojeller için %10 akrilamid ile %0.075 bis-akrilamid karıştırın. 20 kPa hidrojeller için %8 akrilamid ile %0.195 bis-akrilamid karıştırın. 70 kPa hidrojeller için %10 akrilamid ile %0.45 bis-akrilamid karıştırın.
NOT: İstenen PA hidrojel sertliğinin elde edilmesiyle ilgili daha fazla ayrıntı başka bir yerde bulunabilir.
- İstenen her hidrojel sertliği için iki sulu çözelti hazırlayın. Çözelti 1'i boncuksuz olacak şekilde ve Çözelti 2'yi %0,03 0,1 μm çapında floresan mikro boncuklar içerecek şekilde hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Çözeltilerin polimerizasyonunu engellediği bilinen oksijeni ortadan kaldırmak için Çözelti 1 ve 2'yi 15 dakika vakumla degazdan arındırın.
- Bir polimerizasyonun başlatılmasını sağlamak için Çözelti 1'e 10 g / mL stok APS çözeltisinin% 0.6'sını ve% 0.43 tetrametiletildiamin (TEMED) ekleyin. Hızlı hareket edin.
- 24 oyuklu çanağın her bir oyuğunun ortasına 3,6 μL Çözelti 1 ekleyin (hazırlanması için adım 1.2'ye bakın).
- Kuyucukları hemen 12 mm işlenmemiş dairesel lamellerle örtün ve Çözelti 1'in tamamen polimerize olması için 20 dakika bekletin.
- Lamellerin çıkarılmasını kolaylaştırmak için ucunda küçük bir kanca oluşturmak için bir şırınga iğnesini bir yüzeye hafifçe vurun. Şırınga iğnesini kullanarak lamelleri kaldırın.
- 10 g/mL stok APS çözeltisinin %0,6'sını ve Çözüm 2'ye %0,43 TEMED ekleyin. 24 oyuklu tabağın her bir oyuğunda ilk katmanın üzerine 2,4 μL karışım biriktirin.
- Çözelti 2'yi 12 mm dairesel cam lamellerle örtün, ikinci katmanın kalınlığının minimum olmasını sağlamak için bir çift forseps kullanarak hafifçe aşağı doğru bastırın. Çözelti 2'nin 20 dakika polimerize olmasına izin verin.
- Kuyucukların her birine 500 μL 50 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) pH 7.5 ekleyin ve ardından şırınga iğnesi ve forseps ile cam lamelleri çıkarın.
- Poliakrilamid hidrojellerin sterilizasyonu, kollajen kaplaması ve dengelenmesi
- Sterilizasyona izin vermek için hidrojelleri doku kültürü başlığında 1 saat UV'ye maruz bırakın.
- % 1 dimetil sülfoksit (DMSO) ve 50 mM HEPES pH = 7.5'te% 0.5 ağırlık / hacim sülfosüksinimidil 6- (4 "azido-2" -nitrofenilamino) heksanoat (Sülfo-SANPAH, Malzeme Tablosuna bakınız) karışımı hazırlayın.
- Bu çözeltiden 200 μL'yi hidrojellerin üst yüzeyine ekleyin. Hızlı hareket ederek, onları etkinleştirmek için 10 dakika boyunca UV'ye (302 nm) maruz bırakın.
- Hidrojelleri 1 mL 50 mM HEPES pH = 7.5 ile iki kez yıkayın. Fazla çapraz bağlayıcının çıkarıldığından emin olmak için gerekirse tekrarlayın.
- Hidrojelleri 50 mM HEPES içinde 200 μL 0.25 mg / mL sıçan kuyruğu Kollajen I (Malzeme Tablosuna bakınız) ile protein kaplayın. Hidrojelleri, kollajen çözeltisi üstte olacak şekilde gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
NOT: Dehidrasyonu/buharlaşmayı önlemek için, çok kuyulu plakaları ikincil bir muhafazaya yerleştirin ve muhafazanın iç çevresine suya batırılmış laboratuvar temizleme dokuları ekleyin.
- Hidrojellerin kalınlığını ölçmek için 40X objektifli bir epifloresan veya konfokal mikroskop kullanın. Bunu, hidrojelin alt (cam yüzeyin olduğu yer) ve üst düzlemlerinin (floresan boncukların yoğunluğunun maksimum olduğu yer) z konumlarını bularak yapın. Ardından yüksekliği belirlemek için z konumlarını çıkarın.
NOT: Hidrojellerin kalınlığını ölçmek için ters çevrilmiş bir epifloresan mikroskobu ve sayısal açıklığı 0.65 olan bir 40X objektif kullandık. Hidrojellerin tam sertliğini doğrulamak için bu noktada Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) ölçümleri de yapılabilir (bkz. Şekil 2).
- İlgilenilen hücreleri hidrojeller üzerine tohumlamadan önce, hidrojellerin üzerine 1 mL ortam ekleyin ve dengeyi sağlamak için 37 °C'de 30 dakika ila 1 saat inkübe edin.
NOT: MCDB-131 tam ortamını ekledik çünkü bu, model konak hücrelerinin (HMEC-1) kültürlendiği ortamdır (ayrıntılar için bkz. adım 2.1).
2. İnsan Mikrovasküler Endotel Hücre Kültürü ve Hidrojeller Üzerinde Tohumlama
- % 10 fetal sığır serumu, 10 ng / mL epidermal büyüme faktörü, 1 μg / mL hidrokortizon ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş MCDB-131 ortamı içeren MCDB-131 tam ortamında HMEC-1 (insan, mikrovasküler endotelyal) hücrelerinin kültürü (bkz.
- Birleşen kültürleri her 3-4 günde bir 1:6 oranında bölün ve hücreleri 40. geçişe kadar tutun.
- Deneyden bir gün önce,% 0.25 tripsin / EDTA kullanarak hücreleri kültür kaplarından ayırın. İlk olarak, hücreleri ve kültür kabını 1x steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve ardından uygun miktarda% 0.25 tripsin / EDTA (100 mm'lik tabak veya 75 cm'lik şişe başına 2 mL, 60 mm'lik tabak başına 1 mL veya 25 cm'lik şişe) ekleyin, hücrelerin substratlarından ayrılmasına izin vermek için şişeyi 37 ° C'de 5-10 dakika inkübe edin.
- İstenilen hacimde MCDB-131 tam ortam ekleyerek tripsini nötralize edin, hücre kümelerini parçalamak için hafifçe pipetleyin ve ardından çözeltiyi konik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
- Hücrelerin eşit olarak dağıldığından emin olmak için hücre çözeltisini hafifçe döndürün ve ardından çözeltiden 20 μL çıkarın ve bir cam hemositometrenin lamel altındaki iki odayı çok nazikçe doldurun.
- Konik santrifüj tüpünde bulunan hücre çözeltisini, 500 x g'da 10 dakika santrifüjleme kullanarak aşağı doğru peletleyin.
- 10 dakikalık bekleme süresi boyunca, bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Bir mikroskop kullanın, 10X objektifle hemositometrenin ızgara çizgilerine odaklanın ve ardından 1 mm x 1 mm'lik bir karedeki hücre sayısını saymak için bir el çetele sayacı kullanın.
- Hemositometreyi 1 mm x 1 mm kareye taşıyın, oradaki hücreleri sayın ve işlemi iki kez daha tekrarlayın. Dört ölçümün ortalamasını hesaplayın ve ardından ortalamayı 104 ile çarpın. Nihai değer, santrifüjlenmekte olan hücre süspansiyonundaki canlı hücrelerin / mL'nin sayısıdır.
- Hücre peletinin bozulmamasını sağlarken sıvıyı konik santrifüj tüpünden çıkarın. MCDB-131 tam ortamındaki hücreleri 4 x 105 hücre / mL konsantrasyonda yeniden süspanse edin.
- Önce hidrojellerin inkübe edildiği ortamı çıkararak ve ardından her bir hidrojel üzerine 1 mL hücre süspansiyonu ekleyerek hidrojeller üzerinde süspansiyon halindeki hücreleri tohumlayın.
3. İnsan Mikrovasküler Endotel Hücrelerinin Listeria monocytogenes (Lm) ile Enfeksiyonu
- Ön hazırlık
NOT: Aşağıdaki çözümleri önceden hazırlayın.
- Streptomisin, kloramfenikol ve gentamisin stokları
- 0.5 g streptomisin sülfatı tartarak ve tamamen 10 mL ultra saf suya çözerek 50 mg / mL streptomisin stok çözeltileri hazırlayın.
- 75 mg kloramfenikol tartarak ve tamamen 10 mL %100 etanol içinde çözerek 7.5 mg / mL kloramfenikol stok çözeltileri hazırlayın.
- 0.2 g gentamisin sülfatı tartarak ve tamamen 10 mL ultra saf suya çözerek 20 mg / mL gentamisin stok çözeltileri hazırlayın.
- Tüm stok çözeltilerini 0,2 μm'lik bir şırınga filtresi ile filtre-sterilize edin ve uzun süreli kullanım için (1-2 ay) -20 °C'de saklayın.
- Beyin kalp infüzyonu (BHI) ortamı ve agar plakaları
- İki adet 1 L'lik şişeyi bulun ve her şişenin içine manyetik bir karıştırma çubuğu ekleyin.
- BHI ortamı için, bir şişeye 37 g BHI tozu ekleyin ve 1 L'ye kadar ultra saf su ekleyin. Şişeyi manyetik bir karıştırma plakasına yerleştirerek çözeltiyi toz eriyene kadar kuvvetlice karıştırın.
- BHI agar plakaları için, ikinci şişeye 37 g BHI tozu ve 15 g granül agar ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 1 L'ye kadar ultra saf su ekleyin.
- Şişelerin kapaklarını çok sıkı olmayan bir şekilde vidalayın ve çözeltileri sıvı ayarını kullanarak veya otoklavın özelliklerine göre otoklavlayın.
- Solüsyonu otoklavdan çıkarın, ardından agar-BHI solüsyonunu 55 °C'ye soğutun. 1 L'lik şişedeki BHI ortamı steril tutulursa, bir aya kadar kullanılabilir.
- Bakteri agar-BHI plakalarını hazırlamak için önce BHI ve agar içeren şişeye (büyütülecek bakteri suşlarına bağlı olarak) uygunsa antibiyotik ekleyin. Hızlı karıştırmaya izin vermek için şişeyi kısaca manyetik bir karıştırma plakasına koyun.
NOT: Burada kullanılan antibiyotikler, kullanılan Lm suşlarına özgüdür, ancak BHI-agar plakalarında gerekli herhangi bir antibiyotik kullanılabilir. 10403S Lm suşları streptomisine dirençli olduğu için 200 μg/mL konsantrasyona streptomisin ve 7.5 μg/mL konsantrasyona kloramfenikol ekledik. Bu suşlar, kloramfenikol asetiltransferaz açık okuma çerçevesini içeren bir plazmit ile konjuge edilmiştir, bu nedenle kloramfenikol direnci.
- Karışımı 10 cm'lik polistiren bakteri kültür plakalarına dökün (plaka başına yaklaşık 20 mL). Kabarcıklardan kurtulmak için, plakaların üst yüzeyini kısa bir süre alevlendirin. Plakaları gece boyunca oda sıcaklığında soğutun.
- Ertesi gün kuru plakaları kapatın ve 4 °C'de saklayın.
- İnsan mikrovasküler endotel hücrelerinin L. monocytogenes ile enfeksiyonu
- Enfeksiyondan üç gün önce, kullanılacak Lm suşunu bir gliserol stoğundan (-80 ° C'de saklanır) 7.5 μg / mL kloramfenikol ve uygunsa 200 μg / mL streptomisin içeren bir BHI-agar plakasına çizin.
NOT: Çizgilenecek suş, yapısal olarak floresan eksprese eden (immün boyama için JAT1045 kullanıldı) veya ActA promotörü altında floresan eksprese eden (akış sitometrisi veya çekiş kuvveti mikroskobu için JAT983 veya JAT985 kullanıldı) vahşi tip veya mutant olabilir.
- Ayrı koloniler oluşana kadar (1-2 gün) plakaları 37 ° C'de inkübe edin.
- Enfeksiyondan bir gün önce, istenen suşu gece boyunca büyütün, BHI ortamında 7.5 μg / mL kloramfenikol (uygunsa) ile 30 ° C'de 150 rpm'de çalkalayın.
- 5 mL BHI ortamını 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne yerleştirin, 7.5 μg/mL kloramfenikol (uygunsa) ekleyin ve ardından steril 10 μL'lik bir uç kullanarak agar plakasından tek bir koloniyi aşılayın.
- Ertesi gün, enfeksiyondan hemen önce, bakteri çözeltisinin optik yoğunluğunu 600 nm'de (OD600) numuneyi 1: 5 oranında seyrelterek ölçün; boşluk olarak hizmet etmek için tek başına BHI içeren bir küvet kullanın.
- Gece boyunca kültürü 0.1'lik bir OD600'e seyreltin ve bakterilerin log faz büyümesine ulaşmasını sağlamak için BHI ortamında 7.5 μg / mL kloramfenikol (uygunsa) ile 30 ° C'de 2 saat çalkalayarak inkübe edin.
- 0.2-0.3 civarında olması beklenen bakteriyel çözeltinin OD600'ünü ölçün. OD600 daha yüksekse, yalnızca BHI ile 0,2 - 0,3'e seyreltin.
- 1 mL bakteri çözeltisini bir mikrosantrifüj tüpüne alın. Oda sıcaklığında santrifüjleme kullanarak 2.000 x g'da 4 dakika döndürün. Süpernatanı çıkarın ve bakteri peletini doku kültürü başlığında 1 mL doku kültürü dereceli PBS'de yeniden süspanse edin. Bakterileri oda sıcaklığında 2.000 x g'da 4 dakika döndürerek iki kez daha yıkayın. Süpernatanı çıkarın ve bakterileri 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin.
- PBS'de yeniden süspanse edilen 10 veya 50 μL bakteriyi 1 mL MCDB-131 tam ortam ile karıştırarak enfeksiyon karışımını hazırlayın ve çok sayıda enfeksiyon için (MOI; yani, konak hücre başına bakteri sayısı) konak hücre başına yaklaşık 50 bakteri veya konak hücre başına 10 bakteri.
- Hidrojelleri veya hücreleri bozmamaya dikkat ederek ortamı 24 oyuklu plakaların kuyularından çıkarın. Hücreleri 1 mL MCDB-131 tam ortam ile 1x yıkayın ve ardından her oyuğa 1 mL bakteri ekleyin.
- MOI'nin belirlenmesi için bir miktar enfeksiyon karışımı (en az 100 μL) bulundurun (bkz. adım 3.3).
- Plakayı kapağıyla örtün ve sızıntıyı önlemek için plakaları polietilen gıda sargısı ile sarın. Plakaları santrifüje yerleştirin ve istilayı senkronize etmek için numuneleri 200 x g'da 10 dakika döndürün. Plakaları doku kültürü inkübatörüne taşıyın ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
- Numuneleri MCDB-131 tam besiyeri ile 4 kez yıkayın ve doku kültürü inkübatörüne taşıyın. 30 dakika daha sonra, ortamı 20 μg / mL gentamisin ile desteklenmiş ortamla değiştirin.
- Enfeksiyon çokluğunun belirlenmesi (MOI)
- Konakçı hücrelerin bakterilerle ilk 30 dakikalık inkübasyonu sırasında, MOI'yi belirlemek için enfeksiyon karışımının 10 kat seri seyreltmelerini hazırlayın. 100 μL enfeksiyon karışımını 900 μL 1x PBS (10-1 seyreltme) ile karıştırarak 10 kat seyreltme yapın. Daha sonra, 100 μL 10-1 seyreltmeyi 900 μL PBS (10-2 seyreltme) ile karıştırın.
- 10-5 seyreltme elde edilene kadar devam edin.
NOT: Tüm çözeltiler seyreltilmeden önce iyice karıştırılmalı ve her adımda taze temiz pipet uçları kullanılmalıdır.
- Seyreltmeler yapıldıktan sonra, 100 μL'lik 10-2 - 10-5 seyreltmeyi BHI / agar / kloramfenikol / streptomisin plakalarının ortasına yerleştirin (uygunsa).
- Bir kanca oluşturmak için pipeti bükmek için ateş kullanarak bir cam pipetten bir yayıcı yapın. Pipeti sterilizasyon için %100 etanole batırın ve ardından etanolü bir alevle yakın.
- Yayıcı soğuduktan sonra, bakteri seyreltmelerini 10-5 seyreltmeden başlayarak daha konsantre karışımlara doğru hareket ederek plakalara homojen bir şekilde yayın. Plakaları 2 gün boyunca 37 ° C'de baş aşağı inkübe edin.
- Koloni yoğunluğuna bağlı olarak, 10-3 ve 10-4 veya 10-4 ve 10-5 seyreltme plakalarının koloni sayısını belirleyin. MOI'yi aşağıdaki gibi hesaplayın:
koloni sayısı × seyreltme faktörü ÷ hacmi ilk eklenen = μL başına koloni oluşturan birim (CFU) sayısı
μL başına CFU sayısı × kuyu başına bakteri karışımı hacmi = kuyu başına CFU sayısı
Kuyu başına CFU sayısı × kuyu başına hücre hacmi = hücre başına bakteri sayısı
NOT: CFU, koloni oluşturan birimler anlamına gelir.
- Nihai MOI'leri elde etmek için MOI'lerin ortalamasını iki plakadan alın.
4. Hücre Dışı Matris Sertliğini Değerlendirmek için Kantitatif Hızlandırılmış Mikroskopi
PA hidrojellerini 24 oyuklu bir plaka üzerinde hazırlayın (bkz. adım 1), HMEC-1 hücrelerini tohumlayın (bkz. adım 2) ve yukarıda açıklandığı gibi gece boyunca JAT983 kültürlerini büyütün (bkz. adım 3).
- Enfeksiyon günü, MCDB-131 tam ortamının mL başına 10 μL bakteri peletini karıştırarak enfeksiyon karışımını hazırlayın. Ortamı 24 oyuklu plakaların oyuklarından dikkatlice çıkarın ve her oyuğa 1,9 mL MCDB-131 tam ortam ve 0,1 mL bakteri karışımı ekleyin.
NOT: Bu tahlilde kullanılan daha düşük MOI, bir konakçı hücreyi istila eden tek bir bakteriden başlayan yayılma olaylarını analiz etmek için gereklidir.
- Plakayı kapağıyla örtün ve sızıntıyı önlemek için plastik bir sargı ile kapatın. Plakaları santrifüje yerleştirin ve istilayı senkronize etmek için numuneleri 200 x g'da 10 dakika döndürün.
- Plakaları doku kültürü inkübatörüne taşıyın ve 5 dakika inkübe edin.
- Numuneleri 4 kez besiyeri ile yıkayın ve doku kültürü inkübatörüne taşıyın. 5-7 dakika daha sonra, ortamı 20 μg / mL gentamisin ile desteklenmiş ortamla değiştirin.
- actA promotörünün, mTagRFP açık okuma çerçevesinin ifadesini açmasına ve sürmesine izin vermek için plakayı inkübatörde fazladan 5 saat inkübe edin.
- Leibovitz'in L-15'ini %10 fetal sığır serumu, 10 ng/mL epidermal büyüme faktörü ve 1 μg/mL hidrokortizon ile destekleyerek canlı bir mikroskopi ortamı hazırlayın.
NOT: L-15 zaten 2 mM L-glutamin içerir, bu nedenle MCDB-131 ortamında olduğu gibi fazladan eklemek gerekli değildir.
- 1 μL 1 mg / mL Hoechst boyasını 1 mL L-15 tam ortam ile karıştırın ve hücrelerin çekirdeklerini boyamak için her bir oyuğa ekleyin. Hücreleri 10 dakika boyunca doku kültürü inkübatörüne yerleştirin ve daha sonra her bir oyukta L-15 tam ortamını 20 μg / mL gentamisin ile desteklenmiş 1 mL L-15 tam ortam ile değiştirin. Plakayı kapağıyla kapatın ve 37 °C'ye dengelenmiş bir mikroskobun çevre bölmesine (Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.
NOT: Görüntüleme için, bir CCD kamera (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 0.75 NA ile 20X hava planı florit hava objektifi ile ters çevrilmiş bir epifloresan mikroskobu kullanıldı. Güç %50'ye ve maruz kalma süresi 50 ms'ye ayarlandı. mCherry için kullanılan mikroskop filtreleri, uyarma ve emisyon için sırasıyla 470/525 nm'dir.
- Lm'nin değişen sertlikteki hidrojeller üzerine ekilen HMEC-1 tek katmanlarından nasıl yayıldığını izlemek için otomatik odaklama özelliğini kullanarak her 5 dakikada bir birden fazla konumu görüntüleyin.
NOT: L-15, HEPES ile tamponlanmıştır, bu nedenle görüntüleme sırasında CO2 kullanılması gerekli değildir.
Tablo 1. Değişen sertliğe sahip poliakrilamid (PA) hidrojellerin bileşimi. Bu tabloda, belirli bir sertliği (Young modülü, E) elde etmek için stok %40 akrilamid çözeltisi yüzdesi ve stok %2 bis-akrilamid çözeltisi yüzdesi farklı sütunlarda belirtilmiştir.
| Young modülü (E, kPa) | Akrilamid % (%40 stoktan) | Bisakrilamid % (%2 stoktan) |
| 0,6 | 3 | 0,045 |
| 3 | 5 | 0,075 |
| 10 | 10 | 0,075 |
| 20 | 8 | 0,195 |
| 70 | 10 | 0,45 |
