Plak Testi ile Deneysel İlaçların Antiviral Etkinliğinin Belirlenmesi

Özet

Kaynak: Yadavalli, T., et al. Herpes simpleks virüsü-1 antivirallerinin etkinliğini incelemek için domuz kornea dokusu eksplantı. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu videoda, enfekte domuz korneasından elde edilen bir virüs kullanılarak plak testi gerçekleştirme yöntemi gösterilmektedir. Domuz korneası, deneysel ilaçların antiviral etkinliğini test etmek için kullanılır.

Protokol

1. Virüs enfeksiyonu ölçümü

>NOT: İlaç tedavisinin etkisini analiz etmek için domuz kornealarından gelen virüs titreleri her gün değerlendirilmelidir.

1. Virüsü ölçmek için, bu deneyde yapıldığı gibi 6 oyuklu bir plaka kullanılıyorsa, Vero hücrelerini oyuk başına 5 x 10⁵ hücre yoğunluğunda tohumlayın. Bunu enfeksiyondan bir gün önce yapın. Virüs ölçümü için birleştiklerinden emin olmak için kaplanmış hücreleri gece boyunca inkübe edin.
2. 500 μL serumsuz ortamı birden fazla mikrosantrifüj tüpüne alın. Serum içermeyen medya dolu tüplere batırılmış steril pamuk uçlu swabı yerleştirin. Pamuklu çubukların kullanımdan önce en az 5 dakika daldırılması ve ıslatılması gerekir.
3. Altta yatan ortamı rahatsız etmeden, enfekte olmuş domuz kornea plakasını bir biyogüvenlik kabinine taşıyın. Islak pamuklu çubukları kullanarak, aşırı basınç uygulamadan enfekte domuz korneasının merkezinden 5 mm çapında saat yönünde 3 tur ve saat yönünün tersine 3 tur yapın.
4. Pamuklu çubuğu serumsuz ortam dolu mikrosantrifüj tüpüne geri yerleştirin ve saat yönünde ve saat yönünün tersine 5 kez döndürün. Pamuklu çubuğun metal ucu, tamamen bir mikrosantrifüj tüpüne sığacak ve kapak kapatılabilecek şekilde kısa kesilmelidir.
5. Çubukla doldurulmuş pamuk ucunu içeren mikrosantrifüj tüpünü bir vorteks makinesine yerleştirin ve 1 dakika boyunca yüksek hızda vorteksleyin.
6. Bu numuneler üzerinde bir plak tahlili yoluyla virüs miktar tayini gerçekleştirin.
   not: Bu miktar belirleme adımının 2. ve 4. günlerde ve isteğe bağlı olarak enfeksiyondan sonraki 6 gün içinde yapılması gerekir.

2. Plak testi ile virüs ölçümü

NOT: Bir plak tahlili yapmak için, Vero hücrelerini büyütün ve 6 oyuklu bir plakaya yerleştirin ve tahlil başlamadan önce hücrelerin %90 birleşimini sağlayın. Bu hücrelerin birleşen 75^cm2'lik bir şişesini kullanın. Aşağıdaki tüm adımların bir biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirilmesi gerekir.

1. Kültür ortamını aspire ettikten sonra şişedeki Vero hücrelerinin birleşik tek tabakasını 10 mL taze fosfat tampon salin (PBS) ile yıkayın. İlk yıkama solüsyonu setini aspire ettikten sonra yıkama adımını PBS ile bir kez daha tekrarlayın.
2. Hücre tek tabakasına 1 mL% 0.05 Tripsin ekleyin. Şişeyi 37 °C'de 5 dakika inkübe edin. Çıplak gözle, hücrelerin şişenin iç yüzeyinden ayrıldığından emin olun. Değilse, şişeyi tekrar incelemeden önce 5 dakika daha bekleyin. Hücreler ayrılmış gibi göründüğünde, hücrelerin şişe yüzeyinden tamamen ayrılmasını sağlamak için tek katmana 9 mL tam ortam ekleyin.
3. Şişedeki tüm hücreleri tüm ortamla birlikte toplayın ve bunları 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
4. Plak tahlili için kullanılan 6 oyuklu plakanın her bir oyuğu için santrifüj tüpünden 300 μL kullanın. 6 oyuklu plakanın her bir kuyusunu 2 mL tam ortam ile doldurun. Plakaları, büyümelerine ve her bir kuyucukta birleşik bir tek tabaka oluşturmalarına izin vermek için gece boyunca inkübatörde bırakın.
5. Bir plak tahlili yapmak için, virüsün miktar tayininden önce numunelerin seri seyreltilmesinin yapılması gerekir.
6. ^10-8'lik bir seyreltmeye ulaşılana kadar serumsuz ortam kullanarak mikro santrifüj tüplerinde virüsün log101 kat seyreltmesini gerçekleştirin. ^10-3 seyreltmede, 6 oyuklu plakadan hücreler üzerindeki büyüme ortamını aspire ettikten sonra 1 mL seyreltmeyi kaplanmış hücrelerin tek tabakasına aktarın, bu enfeksiyon adımı olacaktır. Enfekte plakayı 37 ° C inkübatörde 2 saat inkübe edin.
7. Mevcut enfeksiyon ortamını aspire edin, hücreleri kaplamak için PBS ile iki kez nazikçe yıkayın ve 6 oyuğun tümüne oyuk başına 2 mL metilselüloz yüklü ortam ekleyin. 72 saat veya plak oluşumu görülene kadar inkübe edin. Plaklar, hücre tek tabakasındaki hücreler arasında küçük boşlukların oluşmasıyla tanımlanabilir.
8. Duvarı kılavuz uç olarak kullanarak her kuyucuğun köşesine yavaşça 1 mL metanol ekleyin. 6 oyuklu plakayı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Hücre tek tabakasını rahatsız etmeden veya çalkalamadan her bir oyuğun içeriğini plakadan yavaşça aspire edin.
9. Tüm hücrelerin kaplandığından emin olarak, 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 1 mL kristal viyole çalışma solüsyonu ekleyin. 6 oyuklu plakayı karanlıkta 30 dakika inkübe edin. Kristal viyole çözeltisini aspire ederek atın ve kuyucukları bir emici kağıt tabakası üzerinde kurutun.
10. Başlangıç solüsyonundaki toplam virüs içeriğini ölçmek için en yüksek seyreltme kuyusundaki plak sayısını sayın. Viral titreyi doğrulamak için işlemi iki kez tekrarlayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
30 G hipodermik iğneler.	Bd	305128
500 mL cam şişe.	Thomas Bilimsel	844027
Biyo-Güvenlik Seviye-2 (BSL-2) sertifikasına sahip biyogüvenlik kabini.	Thermofisher Bilimsel	Herasafe 2030i
Calgiswab 6 "Steril Kalsiyum Aljinat Standart Swablar.	püriten	22029501
Hücre sıyırıcı - 25 cm	Biyoloji BE	70-1180 70-1250
santrifüj tüpü
Kristal menekşe	Sigma Aldrich	C6158	Tozu karanlık bir yerde saklayın
Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle'ın ortamı - DMEM	GIBCO Bilişim Teknolojileri	41966029	Kullanana kadar 4 °C'de saklayın
etanol	Sigma Aldrich	E7023
Fetal sığır serumu -FBS	Sigma Aldrich	F2442	50 mL'lik tüplere koyun ve kullanana kadar donmuş halde tutun
Vero hücreleri	Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu ATCC	CRL-1586
Vorteks makinesi
metanol
Metilselüloz
Mikrosantrifüj tüpü
Domuz Korneaları	Park Ambalaj A.Ş., Chicago, IL		İstek üzerine özel sipariş
Prosedür tezgah kapakları - gerektiği gibi.	Thermofisher Bilimsel	S42400 Serisi
Serolojik Pipetler	Thomas Bilimsel	P7132, P7127, P7128, P7129, P7137
Serolojik Pipetleme ekipmanı.	Thomas Bilimsel	Ezpette Pro
Stereoskop	Carl Zeiss	SteREO Keşif V20
Doku kültürü şişeleri, T175 cm2.	Thomas Bilimsel	T1275
%5 CO2 ve 37 °C sıcaklıkta kalabilen doku kültürü inkübatörleri	Thermofisher Bilimsel	Forma 50145523
Doku kültürü ile muamele edilmiş plakalar (6 oyuklu).	Thomas Bilimsel	T1006
Tripsin

· Serisi · Serisi · Serisi Serisi · Serisi Serisi