Virüsle Enfekte Hücrelerde Polimikrobiyal Biyofilm Başlangıcını Belirlemek İçin Bir Test

Özet

Kaynak: Plotkin, B. J. et al., Bakteri ve Mantarlar Tarafından Virüsle Enfekte Hücrelerde Biyofilm Başlangıcının Belirlenmesi. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, bakteri ve mantarlar tarafından virüs bulaşmış hücrelerde polimikrobiyal biyofilm oluşumunun başlatılmasını göstermektedir. Herpes simpleks virüsü enfeksiyonu, bakterilerin hücrelere bağlanmasını engelleyerek bakteriyel-fungal ko-lokalizasyonunu önler. Buna karşılık, enfekte olmamış hücreler bakteri-mantar kolokalizasyonu ve biyofilm oluşumunun başlamasını gösterir.

Protokol

1. HSV Suşları ve Kullanımı

NOT: Test için beta-galaktosidaz raportör aktivitesine sahip rekombinant yayılmayan HSV-1 (KOS) gL86 ve HSV-2 (KOS) 333gJ^- kullanılmıştır.

1. Virüsü tek bir partiden kullanın ve -80 ° C'de, Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's medium'unun (DMEM) 1: 1 oranında fetal sığır serumu (FBS) ve kullanıma kadar yağsız süt ile saklayın. Viral lot depolamadan önce, o-nitrofenil-β-D-galaktopiranosid (ONPG) ve 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranosid (X-Gal) testi ile virüs konsantrasyonunu belirleyin.
2. Daha önce tarif edildiği gibi, raportör virüs giriş testi kullanılarak çalıştırılan her deneysel test için X-Gal boyama ile virüs canlılığını ve enfeksiyon çokluğunu (MOI) belirleyin (Şekil 1).
3. Virüsü (Opt-MEM) istenen MOI'ye seyreltin. Boyamadan önce tek katmanları (paraformaldehit; 0.5 ml / kuyu) sabitleyin. Virüs canlılık kontrollerini polimikrobiyal tahlil plakalarına paralel olarak ayrı bir mikrotitre plakasına yerleştirin.

2. HeLa 299 Hücre İşleme

1. 37 ° C'de,% 5 CO₂

Sonuçlar

Şekil 1. HeLa Hücrelerinde Doza Bağlı HSV-1 Enfeksiyonunun X-gal Boyama Resimleri. Çeşitli MOI ve X-Gal'de HSV-1 ile enfekte olmuş HeLa hücreleri. (A) X-Gal lekeli sahte enfekte HeLa hücre kontrolü ile 96 oyuklu plakanın kuyusundaki HeLa hücreleri; 20x başlangıç büyütme; (B) 10 oyuklu bir enfeksiyon çokluğunda (MOI) HSV-1 ile enfekte olmuş X-Gal boyalı HeLa hücresi il...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
C.albicans
BBL Sabouraud Dekstroz	Bd	211584
Mantar Agar	Nokta Bilimsel	7205bir
S.aureus (S.aureus)
Mannitol Tuzu Agar	Troya Biyolojisi	7143B
Koyun kanı agar	Troya Biyolojisi	221239
Hela hücreleri
1xDMEM (Dubelcco'nun Modifiye Eagle Medium, 4.5 g / L glikoz ve L-glutamin ile, sodyum piruvat içermez	Corning	10-017-CM
Gentamisin 50mg / ml	Sigma	1397	Tam DMEM'de 50μg / ml nihai konsantrasyon
Tripsin EDTA (% 0.05 Tripsin, 0.53M EDTA) Çözelti 1X	Corning	25-052-CI
Fetal Sığır Serumu	Atlanta Biyoloji	S11150 Serisi	Tam DMEM'de% 10 nihai konsantrasyon
Diğer ortam ve reaktifler
ONPG (Türkçe)	Termo Bilimsel	34055
Ultra Saf X gal	Canlandırıcı	15520-018
1x HBSS (Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi)	Corning	20-021-Özgeçmiş
1XPBS (İngilizce)	Nokta Bilimsel	30042-500
RIPA Lizisi	Yaşam Teknolojileri	89901
Malzemeleri
96 kuyulu plakalar	Yaprak Dökmeyen Bilimsel	222-8030-01F
Kültür tüpleri 100x13	Thomas Bilimsel	9187L61

arası