1. Çözümler ve Medya
- Tablo 2'e göre 1640X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 orta, fosfat tamponlu salin (PBS), Sabouraud dekstroz suyu ve Sabouraud dekstroz agar hazırlayın.
2. Mantar İnokulum Büyüme Koşulları
- Tüm mantar suşlarını, ihtiyaç duyulana kadar -80 °C'de% 35 gliserol içinde donmuş stoklar olarak saklayın.
- Her denemeden önce aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
- Candida albicans suşları için:
- Bir stok şişesini çözdürün ve 200 μL ila 10 mL Sabouraud dekstroz suyunu steril bir 50 mL polipropilen tüpte bir kapakla aktarın ve gece boyunca 30 ° C'de çalkalama (200 rpm) ile kültürleyin. Kültürün daha iyi havalandırılması için tüpü eğmeyi ve kapağı hafifçe açık bırakmayı unutmayın.
- Cryptococcus neoformans suşları için:
- Bir stok şişesinin donmuş yüzeyini kazıyın. Hücreleri Sabouraud dekstroz agar plakalarına yerleştirin ve 30 ° C'de 48 saat inkübe edin. İzole edilmiş kolonilerin gözle görülür şekilde büyümesinden sonra, plakaları buzdolabında (4 ° C) parafin film ile kapalı olarak 15 güne kadar saklayın.
- Steril bir kürdan veya steril aşılama halkası kullanarak plakadan orta büyüklükte izole bir koloni toplayın ve steril 50 mL'lik konik bir tüpte 10 mL Sabouraud dekstroz suyunu aşılayın. Çalkalama (200 rpm) altında 30 ° C'de yaklaşık 24 saat inkübe edin.
- 24 saatlik inkübasyonu aşmayın. Daha iyi havalandırma için tüpü eğmeyi ve kapağı biraz açık bırakmayı unutmayın. Antimikrobiyal direnci etkileyen önemli bir faktör olduğundan, her testten önce hücrelerin büyüme aşamasını standartlaştırmak her zaman iyidir.
not: Her iki mantar da deneylerimizde hızlı yayılma için 30 ° C'de büyütüldü, ancak sıcaklık, örneğin klinik tedavi (37 ° C) gibi çalışmanın amaçlarını yansıtacak şekilde değiştirilebilir. En önemlisi, bu ilk kuluçka süresi, her mantar izolatı için önceden belirlenmeli ve tekrarlanabilirliği sağlamak için tüm testler boyunca korunmalıdır.
- Mantar büyümesinden sonra, konik tüpleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.200 x g'da santrifüjleyerek hücreleri toplayın. Süpernatanı atın ve 10 mL PBS ekleyin.
- Hücreleri yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.200 x g'da tekrar santrifüjleyin.
- PBS yıkama ve santrifüjlemeyi iki kez daha tekrarlayın. Üçüncü yıkamadan sonra, hücreleri 5 mL'de (pelet boyutuna göre) 2X RPMI-1640 ortamında yeniden süspanse edin.
- Bir mikrosantrifüj tüpünde 1 mL 1:100 veya 1:1,000 seyreltme hazırlayın (hücre süspansiyonunun bulanıklığına bağlı olarak).
- Bu seyreltmenin 10 μL'sini çıkarın, bir hemositometre odasına yerleştirin ve mikroskop altında dört köşe kadranındaki toplam hücre sayısını sayın. Konsantrasyonu aşağıdaki formüle göre hesaplayın: (toplam hücre sayısı / 4) x seyreltme faktörü x 104 (oda seyreltme sabiti).
- İncelenen izolat için canlılık sayıları ve büyüme koşulları sistematik olarak ilişkilendirilmişse% 100 yaşayabilirliği düşünün.
not: Canlılık sayımlarının standardizasyonu ve kalite kontrolü, mayalar için Avrupa Antimikrobiyal Duyarlılık Testi Komitesi (EUCAST) antifungal Minimum İnhibitör Konsantrasyon (MIC) yöntemine uygun olarak geri kaplama ile yapılabilir.
- İncelenen izolat için büyüme / canlılık korelasyonu kurulmamışsa, floksin B11, tripan mavisi veya Janus Green gibi ölü hücreleri seçici olarak renklendiren boyaların yardımıyla bir hemositometredeki canlı hücreleri sayarak mantar canlılığını ölçün. Bu protokol için mantar hücrelerini yalnızca bu noktada popülasyonun canlılığı %90 veya üzerindeyse kullanın.
NOT: Ölü/canlı boyalar, tercih edilen mantarla iyi çalışmayabilir. Lütfen kullanmadan önce test edin. Örneğin, tripan mavisi boyası C. neoformans ile iyi çalışmaz.
- Bundan sonra, hücre süspansiyonlarını 2X RPMI-1640 ortamında hazırlayın (RPMI-1640 ortamında 2X ayarlanmış aşılama). 96 oyuklu plakalar için, her plaka için 5 mL'lik bir hacim düşünün.
- Tüm C. albicans suşları için, 4 x 103 hücre / mL'lik bir stok hücre süspansiyonu hazırlayın. Bu konsantrasyon, her bir oyuktaki nihai hücre konsantrasyonunun 2 katıdır (2 x 10,3 hücre / mL).
- C. neoformans suşları için, 2 x 104 hücre / mL'lik bir stok kültürü hazırlayın. Bu konsantrasyon, her bir oyuktaki son hücre konsantrasyonunun iki katıdır (1 x 10,4 hücre / mL).
- Diğer mantarlar için, kuluçka süresi ile ilgili olarak belirli bir çalışma için hangi konsantrasyonun ideal olacağı bilinen bir antifungal ile test edin. Mantarın metabolizmasını ve çoğalma süresini göz önünde bulundurun.
3. Peptitler (Bilinmeyen Ajan)
- Liyofilize peptitleri -20 °C'de saklayın ve her deneyden önce deiyonize suda çözün. Suda çözündükten sonra maksimum depolama süresi, her bir peptidin doğasına bağlı olacaktır.
- Tahlilde test edilen en yüksek nihai konsantrasyonun iki katı alikotlar hazırlayın (2X). İdeal olarak, donma-çözülme döngülerini önlemek için bir kerelik kullanım için yeterli peptit içeren az sayıda alikot hazırlayın.
not: Konsantrasyon seçimi literatüre ve peptidin özelliklerine dayanmalıdır. Seri seyreltmelerin yaklaşık 100 μM peptit ile başlatılması ve daha sonra elde edilen sonuçlara bağlı olarak bu konsantrasyon aralığının azaltılması veya arttırılması önerilir.
4. Referans Antifungaller (Pozitif Kontroller)
- Suda seyreltilmiş olanlar için: analizin en yüksek konsantrasyonundan 2X'lik bir çözelti hazırlayın (seyreltme adımları için Bölüm 5: Antifungal Test'e bakınız).
- C. albicans suşları için 128 μg/mL flukonazol veya 128 μg/mL kaspofungin çözeltisi hazırlayın. Her ikisi için de plaka konsantrasyonu 64 μg/mL olacaktır.
- C. neoformans suşları için 32 μg/mL amfoterisin B (suda çözünür çözelti) çözeltisi hazırlayın. Plaka konsantrasyonu 16 μg/mL.
olacaktır
NOT: Normalde amfoterisin B, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde seyreltilir, çünkü bu mantar önleyici suda az çözünür. Bununla birlikte, ticari olarak temin edilebilen suda çözünür amfoterisin B preparatları vardır.
- Organik bir çözücü içinde seyreltilmiş antifungaller için: DMSO'da 100X'lik bir stok çözeltisi hazırlayın, ardından kullanım için suda 10X'e seyreltin.
not: Bu nedenle, kuyuda, DMSO'nun nihai konsantrasyonu% 1'i geçmeyecektir. Bazı mantarların bu çözücü konsantrasyonunu iyi tolere etmediği göz önüne alındığında, mantarın kontrol olarak %1 DMSO içeren ortamlarda büyüyeceği bir kuyu. DMSO'nun ışığa duyarlı olduğunu unutmayın, bu nedenle plakayı folyo ile örtün veya inkübasyon süresi boyunca karanlık bir odaya koyun.
5. Antifungal Test
>NOT: İn vitro antifungal testler, Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) M27-A3 kılavuzlarından alınan et suyu mikrodilüsyon duyarlılık testine dayalı olarak bazı modifikasyonlarla gerçekleştirilir.
- Her bir peptidin iki kat seri seyreltmesini hazırlayın ve 96 oyuklu polistiren mikroplakalarda antifungalleri 50 μL'lik bir nihai hacme kadar kontrol edin.
- Bir pipet kullanarak, A satırındaki 1-3 numaralı sütunlarda istenen en yüksek nihai konsantrasyonun 2X konsantrasyonunda 100 μL antifungal/peptit ekleyin.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak, B'den H'ye kadar olan sıralar halinde diğer kuyucuklara 50 μL steril su ekleyin.
- En yüksek konsantrasyona sahip oyuklardan 50 μL'yi çıkarın (sıra A), bir sonraki konsantrasyonun bir sonraki kuyucuğuna (sıra B) aktarın ve homojenize edin.
- En düşük konsantrasyona sahip kuyuya kadar yukarıdaki adımları tekrarlayın ve bu kuyucuğun 50 μL'sini atın (satır H). Sütun 11 ve 12'yi (A, B, C satırları) boş kontrol veya negatif/büyüme kontrolü için yalnızca su ile bırakın.
- Her bir oyuğa RPMI-1640 ortamında 50 μL 2X ayarlanmış inokülum ekleyin (sütun 1-3 artı sütun 11 (negatif / büyüme kontrolü)); C. albicans için son konsantrasyon 2 x 103 hücre / mL olacaktır ve C. neoformans suşları için son konsantrasyon 104 hücre / mL olacaktır.
- Boş kontrolleri (50 μL su + 50 μL 2X RPMI-1640 hücresiz ortam) ve negatif/büyüme kontrolünü (50 μL su + 50 μL ayarlı inokulum 2X RPMI-1640 ortamı, antifungal olmayan) hazırlayın ve yukarıda açıklandığı gibi kuyu plakasına yükleyin.
- Test edilecek her bileşik ve seçilen antifungal kontrol için prosedürü tekrarlayın (sütun 4-10).
not: Seri seyreltmeler, aşağıdaki deney gibi dikey olarak veya plakada yatay olarak yapılabilir (yani, test edilmesi gereken verilen bileşiğin/ekstraktın seyreltme sayısı sekiz veya daha fazla ise).
- Bileşikler, referans ilaçlar veya bileşenlerinden herhangi biri ışığa duyarlıysa, testi düşük ışıkta gerçekleştirin, plakaları folyo ile örtün veya inkübasyonlar sırasında karanlık bir odaya yerleştirin.
- Aşağıdaki isteğe bağlı önerileri göz önünde bulundurun.
- Plakayı, buharlaşmayı azaltmaya yardımcı olduğu için gaz değişimine izin veren şeffaf bir kapak plakası ile kapatın.
- Plakayı nemli bir odaya yerleştirin; ayrıca buharlaşmayı azaltmaya da yardımcı olacaktır.
- Plakaları 37 ° C'de tüm C. albicans suşları için 24 saat veya 48 saat ve C. neoformans için 200 rpm çalkalama ile 48 saat inkübe edin. Alt nihai hacim (100 μL), yayılma olmamasını sağlar.
not: C. albicans suşları için 24 saat ile 48 saat arasındaki MIC okumaları arasında anlamlı bir fark gözlenmedi. Bununla birlikte, 48 saatteki okumaları görselleştirmek daha kolaydır.
- Morfolojideki değişiklikleri doğrulamak ve kontaminasyon belirtilerini kontrol etmek için inkübasyon süresinden önce ve sonra ters çevrilmiş bir optik mikroskop yardımıyla tüm kuyucukları gözlemleyin.
not: Okumalar görsel olarak yapılabilir ve deneyin sonunda fotoğraflanabilir. Her okumadan önce plakayı hafifçe homojen hale getirin. Okumalar, hücre kümeleri veya filamentasyon gözlenmezse, OD'si 600 nm'de ölçülerek de gerçekleştirilebilir.
- Deneyleri ayrı tarihlerde en az üç kez gerçekleştirin.
Tablo 1. Ortam ve reaktif hazırlama.
| Orta | hazırlık |
| >2X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 orta – 500 mL | 10,4 g RPMI-1640 (L-glutamin ve fenol kırmızısı ile desteklenmiş; bikarbonat olmadan) |
| 330 mM 3-(N-morfolino) propan sülfonik asit (MOPS) |
| NaOH ile pH 7.0'a ayarlayın |
| Filtrasyon ile sterilize edin (0,22 μM filtre) |
| Fosfat tamponlu salin (PBS) | 137 mM NaCl |
| 2,7 mM KCl |
| 10 mM Na2HPO4 |
| 2 mM KH2PO4 |
| 121°C'de 15 dakika otoklavlayın. |
| Sabouraud dekstroz suyu | 500 mL damıtılmış su içinde 15 g toz. |
| NaOH ile pH 7.0'a ayarlayın |
| 121°C'de 15 dakika otoklavlayın. |
| Sabouraud Dextrose Agar | 500 mL damıtılmış suda 32,5 g toz. |
| NaOH ile pH 7.0'a ayarlayın |
| 121°C'de 15 dakika otoklavlayın. |
