$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. GC toplamalarının canlılık nicelemesi
- Steril bir aplikatör kullanarak GC toplayın. GC'yi plakadan alın ve GC'yi önceden ısıtılmış et suyunda (GCP, Tablo 1) %4.2 NaHCO3 ve %1 Kellogg solüsyonları ile takviye edin. Asılı bakteri konsantrasyonunu belirlemek için 650 nm dalga boyunda (1 = ~ 1 x 109 CFU/mL OD 650) spektrofotometri kullanın.
- GC konsantrasyonunu ~ 1 x 108 CFU / mL olarak ayarlayın.
- 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına 99 μL ayarlanmış GC süspansiyonu ekleyin.
- Bakterilerin toplanmasına izin vermek için plakayı 37 ° C'de% 5 CO2 ile 6 saat inkübe edin.
- Her kuyucuğa 1 μL seri seyreltilmiş seftriakson (1000, 100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0.8, 0.4, 0.2 μg / mL) ekleyin. Kontrol görevi görmesi için bazı kuyuları tedavi edilmeden bırakın.
- Plakayı 37 ° C'de 24 saat boyunca% 5 CO2 ile inkübe edin.
- Süspansiyonu 144 W ve 20 kHz'de 5 saniye boyunca her bir kuyucukta 3 kez sonikleştirin.
- Her bir oyuğa 100 μL ticari olarak temin edilebilen ATP kullanım kızdırma reaktifi ekleyin, 3 kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve %5 CO2 ile 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
- Her bir oyuktan 150 μL karışımı 96 oyuklu siyah bir mikroplakada yeni bir kuyucuğa dikkatlice aktarın ve kabarcıklar oluşturmaktan kaçının.
- Plaka okuyucuyu kullanarak her bir kuyucuğun emilimini 560 nm'de ölçün.
- Seri seftriakson tedavisinden sonra elde edilen okumanın tedavi edilmemiş kuyulardan alınan okumaya oranı ile hayatta kalma oranını hesaplayın.
2. GC agregalarının Canlı/Ölülerinin floresan mikroskobik analizi
- Steril bir aplikatör kullanarak GC toplayın. GC'yi plakadan alın ve GC'yi önceden ısıtılmış GCP ortamında ve% 1 Kellogg takviyelerinde yeniden askıya alın.
- 650 nm dalga boyunda spektrofotometri ile bakteri sayısını belirleyin ve GC konsantrasyonunu ~ 1 x 107 CFU / mL olarak ayarlayın.
- 8 oyuklu lamel tabanlı bölmelere 198 μL GC süspansiyonu ekleyin.
- Agregasyon oluşumuna izin vermek için odayı 37 ° C'de% 5 CO2 ile 6 saat inkübe edin.
- Her agregasyon koşulu içinde her bir oyuğa 2 μL seftriakson (100 μg / mL veya çeşitli seyreltmeler) ekleyin. İstenilen süre boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe edin.
- Her bir oyuğa 0.6 μL canlı / ölü boyama çözeltisi karışımı ekleyin ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
- Konfokal bir mikroskop kullanarak Z serisi görüntüler elde edin (eşdeğer bir mikroskop kullanılabilir).
- GC agregalarının boyutunun ve her bir agregadaki canlı-ölü boyamanın floresan yoğunluk oranı FIR'ın ölçümü için ImageJ yazılımını kullanarak görüntüleri analiz edin.
Tablo 1: 1 L GCP bakteri üreme ortamı tarifi.
