Lenfoma hücresinin bir test ilacına duyarlılığında nötrofil benzeri hücrelerin rolünün belirlenmesi

Özet

Kaynak: Hirz, T., et al. Terapötik Ajanlara Lenfoma Hücre Duyarlılığındaki Rollerini Belirlemek için Nötrofil İzolasyonu ve Analizi. J. Vis. Uzm. (2016).

Bu video, lenfoma hücrelerini kemoterapötik ajanların sitotoksisitesine karşı korumada nötrofil benzeri hücrelerin rolünü araştıran bir testi göstermektedir. Lenfoma ve nötrofil benzeri hücrelerden oluşan bir 3D ko-kültür kurulur ve bir kemoterapi ilacı olan vinkristin'e maruz bırakılır. Nötrofil benzeri hücrelerle doğrudan temas, lenfoma hücrelerinde anti-apoptotik proteinlerin yukarı regülasyonuna neden olur, böylece vinkristin varlığında hayatta kalmalarını teşvik eder.

Protokol

1. HL60 Hücrelerinin Granülositik Yol Boyunca Farklılaşması ve RL Lenfoma B Hücreleri ile Kokültürlerinin 3D Modelde Değerlendirilmesi

1. İnsan Promiyelositik (HL60) Hücrelerin Nötrofil Benzeri Hücrelere Farklılaşması
   1. HL60 hücre sayısını 3 x 10⁵ hücre / ml olarak ayarlayın, ardından farklılaşmalarını indüklemek için 1 μM retinoik asit (RA) ve% 1.25 DMSO ekleyin. Her 3 x 10⁵ HL60 hücresini 48 oyuklu plakada tohumlayın, ardından 37 ° C'de% 5 CO₂ ile 48 saat inkübe edin.
   2. Daha sonra hücreleri toplayın ve RT'de 5 dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyin. Hücre canlılığı sayacını kullanarak saymak için hücreleri tam RPMI ortamıyla yeniden askıya alın.
   3. Daha sonra, HL60 hücre sayısını 3 x 10⁵ hücre / ml'ye ayarlamak için hücre süspansiyonunu tam RPMI ortamında seyreltin ve 1 μM retinoik asit (RA) ve% 1.25 Dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyerek farklılaşmalarını tekrar indükleyin. Her 3 x 10⁵ HL60 hücresini 48 oyuklu plakada tohumlayın ve 37 ° C'de% 5 CO₂ ile 48 saat daha inkübe edin.
2. HL60 farklılaşmasının analizi (HL60farkı)
   1. Hücreleri toplayın ve tüpleri RT'de 5 dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyin. Hücre canlılığı sayacını kullanarak saymak için peleti eksiksiz Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamıyla yeniden askıya alın.
   2. Akış sitometrisi ile hücre yüzeyi belirteçlerinin ekspresyonundaki değişiklikleri analiz etmek. Floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) analizi için her 3 x 10⁵ farklılaşmamış HL60 hücresini (hücre kültüründen) ve 3 x 10⁵ HL60diff hücresini 5 ml'lik plastik tüplere yerleştirin ve tüpleri RT'de 5 dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyin.
   3. Peletleri 50 μl Fosfat tamponlu salin (PBS)-Fetal sığır serumu (FBS) (% 4) içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri AF700'e konjuge anti-insan CD11b veya APC'ye konjuge anti-insan CD38 (5 μl / 10⁶ hücre) ile etiketleyin. Hücreleri karanlıkta 4 ^{° C'de}30 dakika inkübe edin.
   4. 500 μl PBS-FBS (% 4) ile yıkayın, ardından RT'de 5 dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyin. Peletleri 200 μl PBS-FBS'de (% 4) yeniden süspanse edin.
   5. Şekil 1A'nın geçit stratejisini ve aşağıdaki optik konfigürasyonu kullanarak akış sitometresinde analiz edin: 488 nm lazer: FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP); 633 nm lazer: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP).
   6. HL60diff'teki morfolojik değişiklikleri test etmek için, hücreleri mikroskobik inceleme için cam slaytlar üzerine hareketsiz hale getirin.
      1. Bunu yapmak için, her 3 x 10⁴ farklılaşmamış HL60 hücresini (hücre kültüründen) ve 3 x 10^{4 HL60} farkını 150 μl tam RPMI ortamında yenidensüspanse edin. Cam slaytları, filtre kartlarını ve numune odalarını sitospin santrifüjünde birleştirin ve santrifüjün dengeli olduğundan emin olun.
      2. Her hücre tipini numune odasına yerleştirin ve RT'de 10 dakika boyunca 1.500 rpm'de sito-santrifüj yapın. Slaytları, filtre kartlarını ve numune odalarını santrifüjden çıkarın. Slayttaki hücrelere zarar vermemek için dikkatlice sökün. Filtre kartlarını ve numune haznelerini atın.
      3. Giemsa boyama kitini kullanarak hücreleri boyayın ve slaytları kuruması için 1 saat bekletin. Hücreleri 100X büyütme ile mikroskopla inceleyin.
3. 3 Boyutlu (3D) Kültür
   not: Bu deneyde kullanılan malzemelerin soğuk olduğundan ve deneyin buz üzerinde yapıldığından emin olun.
   1. Her 5 x 10⁴ RL hücresini, tek başına veya RL:HL60diff 1:10 oranında HL60diff ile karıştırılarak, açıklığı yaklaşık 2 ila 3 mm'ye genişletmek için steril bir makasla kesilmiş 1 ml pipet ucu kullanarak 300 μl bazal membran matrisi ile yeniden süspanse edin. Bu adım sırasında kabarcıklardan kaçının.
   2. Her 300 μl hücre süspansiyonunu / kuyusunu 24 oyuklu plakaya tohumlayın. Bu adım sırasında baloncuklardan kaçının. Plakayı 37 ° C'de% 5 CO₂ ile 30 dakika inkübe edin, daha sonra her kuyucuk için 1 ml tam RPMI ortamı ekleyin ve% 5 CO₂ ile 37 ° C'de 7 gün inkübe edin. Ortamı iki günde bir değiştirin. 5. günde 10 nM vincristine ekleyin.
4. FACS Analizi
   1. 7 günlük kültürden sonra, ortamı aspire edin ve her bir kuyuyu iki kez 1 ml buz gibi soğuk PBS ile yıkayın. 3 ml / kuyu buz gibi soğuk PBS-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (5 mM) ekleyin. 200 μl'lik pipet ucunun tabanını kullanarak kazıyarak jeli kuyunun dibinden ayırın. Plakayı 30 dakika boyunca buz üzerinde hafifçe çalkalayın.
   2. Hücre süspansiyonunu steril 15 ml'lik tüpe aktarın ve tüpleri 30 dakika daha buz üzerinde hafifçe çalkalayın. Homojen hücre süspansiyonunun görünümünü kontrol edin. (Aksi takdirde, hücreleri daha uzun süre sallayın veya daha fazla PBS-EDTA ekleyin).
   3. Tüpleri RT'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Peletleri PBS ile yıkayın, ardından RT'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
   4. PBS-FBS (% 4) ile yeniden süspansiyon yapın ve PE-Cy7'ye konjuge edilmiş anti-insan CD19 antikoru ve APC'ye konjuge anti-insan CD38 antikoru (5 μl / 10,⁶ hücre) ile etiketleyin. Karanlıkta 4 ^{° C'de}30 dakika inkübe edin.
   5. 500 μl PBS-FBS (% 4) ile yıkayın, ardından tüpleri RT'de 5 dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyin. Ticari kit kullanarak hücreleri Annexin V ve PI ile yeniden süspanse edin.
   6. Şekil 2A'nın geçit stratejisini ve aşağıdaki optik konfigürasyonu kullanarak akış sitometresi üzerinde analiz edin: 488 nm lazer: FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610/20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633 nm lazer: APC (660/20 BP). Renk telafisinden emin olun.

Sonuçlar

Şekil 1. Farklılaşmış HL60 Hücrelerinin Yapısal Parametreleri. (A) İleri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) grafikleri, HL60 ve farklılaşmış HL60 hücrelerini (HL60diff) temsil eder. (B) HL60 ve HL60diferansiyel hücreleri, anti-CD11b-AF700 veya anti-CD38-APC ile işaretlendi ve ardından akış sitometrisi analizi yapıldı. FSC-A ve SSC-A dağılım grafiğind...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
dev/dak 1640	Gibco Canlandırıcı	21875-034
Fetal sığır serumu (FBS)	Gibco Canlandırıcı	10270-106
Fosfat tamponlu salin (PBS kalsiyum ve magnezyum içerir)	Gibco Canlandırıcı	14040-091
Vinkristin	EG labo
BD Matrigel bazal membran matrisi	BD Biyolojik Bilimler	354234	Deney gününden önce gece boyunca 4 oC'ye koyun
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Retinoik asit	Sigma-Aldrich	R2625 Serisi
Sığır serum albümini (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Ek V-FLOUS boyama kiti	Roche	11 988 549 001
Kit RAL 555 Modifiye Giemsa boyama kiti	Kozmos Biyomedikal	CB361550-0000
LSRII akış sitometrisi	BD Biyolojik Bilimler
Sitosantrifüj	Termo Bilimsel
Leica DMR-XA mikroskobu	Leica Mikro Sistemler
Cellometer Otomatik T4 Hücre Canlılık Sayacı	Nexcelom Biyobilim

Gazetesi Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi