Sitotoksik T Lenfosit Yanıtlarında İmmün Baskınlığı Değerlendirmek İçin Bir Test

Özet

Kaynak: Choi, J. ve diğerleri, Tümöre özgü CD8⁺ T Hücresi Yanıtlarında İmmünodominansı İncelemek için İn Vivo Sitotoksisite Testlerinin Uyarlanması. J. Vis. Uzm. (2019)

Video, sitotoksik T lenfositlerinde veya CTL yanıtlarında immünodominansı test etmek için akış sitometrisi tabanlı bir testi göstermektedir. Enjekte edilen floresan hedef hücreler, immünojenik epitoplara karşılık gelen değişen floresan sergiler. Dalak sonrası toplama ve sınıflandırma, yüksek yoğunluklu floresan hücrelerde bir azalma olduğunu ortaya koyarak CTL yanıtlarında immünodominansı doğrular.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. C57BL/6 Farelerin T Ag Eksprese Eden Tümör Hücreleri ile Aşılanması

1. SV40 ile dönüştürülmüş fibrosarkom hücre hattı C57SV'yi (veya benzer bir T ^{Ag +} yapışkan hücre hattı) Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's besiyerinde (DMEM) 4.5 g / L D-glikoz ve L-glutamin (1x) ile büyütün ve 1 mM sodyum piruvat ve% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) ile% 10 karbondioksit (CO₂) içeren nemlendirilmiş atmosferde 37 ° C'de doku kültürü ile muamele edilmiş şişelerde.
2. Hücreler tamamen birleştiğinde veya hafifçe aşırı birleştiğinde, ortamı nazikçe çıkarın ve atın ve tek tabakayı önceden ısıtılmış steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile durulayın.
   NOT: Maksimum T Ag ekspresyonu, T Ag ⁺ hücreleri 0 birleşmeye ulaştığında elde edilir.
3. Biyolojik bir güvenlik kabininin içine, hücreler yamalar halinde yerinden çıkana kadar oda sıcaklığında tek tabakayı kaplamak için önceden ısıtılmış tripsin-etilendiamintetraasetik asit (tripsin-EDTA) (%0.25) ekleyin. Kalan yapışkan hücreleri serbest bırakmak için kültür şişelerinin kenarlarına birkaç kez vurun.
   NOT: Gerekirse ve tripsinizasyon sürecini hızlandırmak için şişe(ler)i 37 °C'lik bir inkübatöre aktarın. Yerinden çıkan hücreler, ışık mikroskobu altında hızlı bir şekilde yuvarlak bir şekil alacaktır. Bu adım yaklaşık 5 dakika sürmelidir.
4. 5 mL DMEM ortamı ekleyin ve her bir şişenin içeriğini yukarı ve aşağı pipetleyerek tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için kümeleri ayırın.
5. Hücre süspansiyonunu 70 μm gözenekli bir hücre süzgecinden bir tüpe aktarın.
6. Tüpü 400 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da döndürün.
7. Süpernatanı atın. Peletlenmiş hücreleri 10 mL steril, soğuk PBS'de yeniden süspanse edin.
8. 1.6 ve 1.7 adımlarını iki kez tekrarlayın.
9. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. 4 x 10⁷ hücre / mL steril PBS içeren düzgün bir süspansiyon hazırlayın.
10. Yukarıdaki süspansiyonun 500 μL'sini intraperitoneal olarak (ip) her yetişkin (6-12 haftalık) erkek veya dişi C57BL / 6 fareye enjekte edin.

2. Tedavi Rejimleri

1. nTreg Hücrelerinin T_CD8 İmmün Baskınlığına Katkısını İncelemek İçin Tedavi Rejimi
   1. C57BL / 6 farelerinin C57SV hücreleri ile in vivo astarlanmasından dört gün önce (adım 1.10), her bir hayvana bir kez i.p. 0.5 mg düşük endotoksin, azid içermeyen anti-CD25 monoklonal antikor (mAb) (klon PC-61.5.3), nTreg hücrelerini tüketen veya bir sıçan IgG1 izotip kontrolü ile (ör., klon KLH / G1-2-2, klon HRPN veya klon TNP6A7).
2. Programlanmış hücre ölümü proteinlerinin (PD-1-PD-L1 (2)) T_CD8 İmmünodominansını Şekillendirmede Etkileşimlerinin İn Vivo Önemini Test Etmek İçin Tedavi Rejimi
   NOT: PD-1'in PD-L1 ile angajmanı sıklıkla, ancak her zaman değil, Ag-spesifik T_CD8'in ko-inhibisyonuna ve / veya tükenmesine aracılık eder. Bu nedenle, anti-PD-1 ile tedavi, biyolojik bir fenomende yer alan kesin hücreler arası etkileşimi ortaya çıkarmak için anti-PD-L1 ve anti-PD-L2 mAb'lerin uygulanmasına paralel olarak gerçekleştirilebilir.

>3. Hedef Splenositlerin Hazırlanması

1. Servikal çıkık ile splenosit donörü olarak görev yapacak cinsiyete uygun naif C57BL / 6 farelere (6-12 haftalık) ötenazi yapın.
2. Her fareyi karnı yukarı bakacak şekilde biyolojik bir güvenlik kabininin içine yerleştirin. Cilde p (h/h) etanol, EtOH püskürtün. Steril forseps ve makas kullanarak cildi kaldırın ve küçük bir ventral orta hat kesisi yapın. Ardından, karın zarını ortaya çıkarmak için cildi haç benzeri bir şekilde kesin.
3. Forseps kullanarak, iç organların hiçbirini kapmadan peritonu çadır benzeri bir şekilde yukarı çekin. Periton boşluğunu ortaya çıkarmak için peritonu kesin ve dalağı nazikçe çıkarın.
4. Dalak (lar) ı 5 mL steril PBS içeren 15 mL Dounce doku öğütücünün içine yerleştirin. Dalak dokusu kırmızı homojen bir hücre süspansiyonuna dönüşene kadar öğütücünün cam pistonunu kullanarak manuel basınç uygulayın.
   NOT: Deney grubu başına düşen alıcı hayvan sayısına bağlı olarak, hedef hücre hazırlığı için birkaç donör fare dalağına ihtiyaç duyulabilir. 15 mL'lik bir öğütücü içinde 3 adede kadar dalak birlikte homojenize edilebilir.
5. Homojenatı 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Tüpü 400 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da döndürün.
6. Süpernatanı atın. Eritrositleri ortadan kaldırmak için peletlenmiş hücreleri 4 mL amonyum-klorür-potasyum (ACK) parçalama tamponunda 4 dakika boyunca yeniden süspanse edin.
   NOT: Bu, zamana duyarlı bir adımdır. Splenositlerin ACK parçalama tamponuna aşırı maruz bırakılması kırılganlıklarını artıracak ve onları spesifik olmayan hücre ölümüne duyarlı hale getirecektir.
7. Her tüpe, ısıyla inaktive edilmiş FBS, L-alanil-L-glutamin, 0.1 mM minimum esansiyel ortam (MEM) esansiyel olmayan amino asitler, 1 mM sodyum piruvat, 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) ve 1x penisilin / streptomisin içeren 8 mL Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) ortamı ekleyin, bu bundan sonra tam RPMI ortamı olarak anılacaktır (Malzeme Tablosu).
8. İçeriği bir hücre süzgecinin 70 μm gözeneklerinden 15 mL'lik yeni bir tüpe aktarın.
9. Tüpü 400 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da döndürün.
10. Süpernatanı atın. Peletlenmiş hücreleri 12 mL tam RPMI'de yeniden süspanse edin.
11. Splenosit süspansiyonunu 3 ayrı tüpte 3 eşit parçaya (her biri 4 mL) bölün.

4. Hedef Splenositlerin Alakasız ve Aynı Kökenli Peptitlerle Kaplanması

1. Tüpleri, hedef splenositleri nabız atmak için kullanılacak peptitlere göre etiketleyin. Kontrol splenositleri, alakasız bir peptit ile darbelenecek ve her bir akraba hedef splenosit popülasyonu, T Ag'den türetilmiş immünodominant epitopa (bölge IV) veya subdominant bir T Ag epitopuna (bölge I veya bölge II/III) karşılık gelen sentetik bir peptit ile darbelenecektir (Tablo 1).
   NOT: Alakasız peptitlerin seçimi, deney düzeneğine ve her araştırmada kullanılan fare türüne bağlıdır. Yazarlar genellikle gB_498-505 (herpes simpleks virüsünün [HSV]-1'in H-2K^b-kısıtlı immünodominant peptit epitopu) ve/veya GP_33-41 (lenfositik koriomenenjit virüsünün H-2D^b-kısıtlı immünodominant peptit epitopu ([LCMV]) C57BL / 6 farelerinde kullanırlar (Tablo 1). Bu peptitler en uygun seçimlerdir, çünkü: (i) burada açıklanan fare modelinde daha önce karşılaşılmayan patojenlerden türetilirler; (ii) T Ag türevi peptitlere benzer şekilde, gB_498-505 ve GP_33-41, H-2^b molekülleri tarafından sınırlandırılır ve bağlanır. 'Üç tepeli' in vivo öldürme deneylerinde, aynı kökenli hedef hücrelere karşılık gelen iki tepenin her biri, immünodominant veya subdominant bir peptit ile darbeli splenositleri temsil edebilir. Her bir peptit setinin seçimi, her deneyin amaçlarına göre değişir. Bu tür varyasyonların örnekleri olarak Şekil 1 ve Şekil 2'ye bakın. Bu protokolün geri kalanı için, T Ag'den türetilen bölgeler I ve IV, sırasıyla subdominant ve immünodominant peptitleri temsil edecektir.
2. Her etiketli tüpün içeriğini 1 μM ilgili peptit ile 37 ° C'de 1 saat ve% 5 CO₂ ile vurun.
3. Gerekirse kümeleri ve kalıntıları temizlemek için her tüp için ayrı bir hücre süzgeci (70 μm gözenekli) kullanın.
4. Tüpü 400 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da döndürün. Süpernatanı atın.
5. Peletlenmiş hücreleri 12 mL steril soğuk PBS'de yeniden süspanse edin ve adım 4.4'ü bir kez daha tekrarlayın.
   NOT: FBS, bir sonraki adımda karboksifloresein süksinimidil Ester'i (CFSE) bağlayabildiğinden, mümkün olduğunca fazla FBS'yi çıkarmak önemlidir.

>5. Hedef splenositlerin CFSE ile etiketlenmesi

1. Peptit darbeli splenositleri 4 mL steril PBS'de yeniden süspanse edin.
2. 0.025 μM, 0.25 μM ve 2 μM'de CFSE'yi sırasıyla alakasız peptit-, site I- ve site IV-darbeli splenositler içeren tüplere ekleyin.
   NOT: Tek tip CFSE etiketlemesi elde etmek için, hücre süspansiyonunun biraz üzerindeki tarafa CFSE eklemeden önce her tüpü 45°'lik bir açıyla tutun ve hemen ardından hafif girdaplama yapın. Bu, sonunda düzgün histogramların görünmesini sağlayacaktır. CFSE yoğunluklarında partiden partiye ve yaşa bağlı farklılıklar nadir değildir. Bu nedenle, kullanılacak optimal konsantrasyonlara karar vermeden önce diferansiyel CFSE dozları ile deney yapılması gerekebilir.
   Dikkat: CFSE, 5 μM'den yüksek konsantrasyonlarda toksiktir.
3. Tüpleri 15 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatörün içine yerleştirin ve her 5 dakikada bir ters çevirin.
4. CFSE reaksiyonunu durdurmak için her tüpe 3 mL ısıyla inaktive edilmiş FBS ekleyin. İçeriği steril PBS ile doldurun.
5. Tüpü 400 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da döndürün. Süpernatanı atın.
6. Peletlenmiş hücreleri 12 mL steril PBS'de yeniden süspanse edin ve adım 5.5'i tekrarlayın.

6. Hedef Splenosit Popülasyonlarının Yeterli/Eşit CFSE Etiketlemesinin İncelenmesi

1. Peletlenmiş hücreleri 3 mL PBS'de yeniden süspanse edin.
2. Tüpleri nazikçe girdaplayın. Her biri 10 μL, CFSE^düşük, CFSE^{orta (int)} ve CFSE^yüksek hücre süspansiyonlarını, 200 μL PBS içeren 5 mL'lik yuvarlak tabanlı polistiren floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) tüpüne aktarın.
3. 488 nm lazerle donatılmış bir akış sitometresi kullanarak hücreleri sorgulayın. FL-1 kanalındaki lenfosit kapısı içine düşen 5000 olayı elde etmeden önce hücrelerin ileri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) özelliklerine dayalı bir lenfosit kapısı çizin.
4. 'Ana' CFSE⁺ popülasyonu içinde, CFSE^düşük, CFSE^int ve CFSE^yüksek alt popülasyonlarını tanımlamak için ek histogram kapıları çizin.
5. Üç geçit içindeki eşit veya eşite yakın olay sayılarını onaylayın. Gerekirse, bölüm 7'de hedef splenositleri saf ve astarlanmış farelere karıştırıp enjekte etmeden önce 'kaynak' tüplerdeki (adım 6.1) hücre sayılarını ayarlayın.

7. CFSE etiketli Hedef Hücrelerin Naif ve T-Ag astarlı Alıcılara Enjeksiyonu

1. Kaynak tüplerini nazikçe girdaplayın. CFSE etiketli üç hücre süspansiyonunu eşit oranlarda yeni bir tüpe aktarın.
2. İçeriği steril PBS ile doldurun.
3. Tüpü 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da döndürün. Peletlenmiş hücreleri steril PBS ile yeniden süspanse edin.
4. En az% 95 hücresel canlılık sağlamak için tripan mavisindeki hücreleri bir hemositometre ile sayın.
5. 1 x 10⁷ karışık hedef hücre / 200 μL PBS'yi intravenöz olarak (i.v.), kuyruk damarı yoluyla her alıcı C57BL / 6 faresine enjekte etmek için hacmi ayarlayın.
   NOT: Hücreleri enjeksiyonlar arasında buz üzerinde saklayın. Her enjeksiyondan önce hedef hücreleri nazikçe karıştırın. Hayvanın ne zaman ötenazi yapılması gerektiğini belirleyecek olan her fare için tam enjeksiyon zamanını kaydedin. Aynı deneydeki tüm hayvanlar arasında in vivo sitotoksisite süresini tutarlı tutmak önemlidir.

8. Veri Toplama

1. CFSE etiketli hedef hücrelerin enjeksiyonundan iki veya dört saat sonra, alıcı farelere servikal çıkık ile ötenazi yapın.
   NOT: İn vivo sitotoksisitenin süresi, kullanılan deneysel sisteme, hedef Ag'lerin immünojenisitesine, dalakta peptit antijenine özgü T_CD8'in beklenen bolluğuna ve diğer faktörlerin yanı sıra litik fonksiyonlarının sağlamlığına bağlı olarak değişebilir.
2. Her dalağı adım 3.2-3.9'daki gibi ayrı ayrı çıkarın ve işleyin.
3. Süpernatanı atın ve peletlenmiş hücreleri 3 mL PBS.
   içinde yeniden süspanse edin NOT: Sitoflorimetrik analizlerden önce dalak dokusunu ve hücre preparatlarını 4 °C'de veya buz üzerinde tutmaya ekstra özen gösterin. Bu, ex vivo olarak devam eden sitotoksisiteyi önlemek içindir.
4. İşlenmiş her dalaktan yaklaşık 1x10⁷ hücreyi temiz bir FACS tüpüne aktarın.
5. 488 nm lazerle donatılmış bir akış sitometresi kullanarak hücreleri hemen sorgulayın. Hücrelerin FSC ve SSC özelliklerine dayalı olarak bir lenfosit kapısı çizin.
6. CFSE^- alıcının splenositlerini ve CFSE ⁺ ile aktarılan hedef hücreleri tanımlayın. Farklı CFSE^düşük, CFSE^int ve CFSE^yüksek hedef hücre popülasyonlarını barındıran ek kapılar çizin.
7. FL-1 kanalında toplam 2000 CFSE^düşük olayı elde edin.

9. Veri Analizi

1. Aşağıdaki formülü kullanarak her bir akraba hedef hücre popülasyonunun spesifik lizizini hesaplayın:
   % Spesifik sitotoksisite =
   burada x = T Ag ile hazırlanmış farede CFSE^int/yüksek olay sayısı, y = T Ag ile hazırlanmış farede CFSE ^düşük olay sayısı, saf farede a = CFSE^int/yüksek olay sayısı ve b = saf farede CFSE^düşük olay numarası.
   not: Birden fazla akraba hedef popülasyonun spesifik lizizinin değerlendirildiği 'üç tepeli' sitotoksisite testlerinde, hedef hücre frekanslarının kullanılması uygun değildir. Bunun nedeni, bir akraba hedef hücre popülasyonunun frekansının yalnızca ilgisiz kontrollerin yüzdesinden değil, aynı zamanda diğer akraba hedef splenositlerin yüzdesinden de etkilenmesidir. Bu nedenle, her bir akraba hedef hücre popülasyonunun (CFSE^int veya CFSE^yüksek hücreleri) CFSE^düşük kontrollerine karşı lizisini doğru bir şekilde hesaplamak için yukarıdaki formülde her bir kapı içindeki olay numaraları kullanılmalıdır.

Tablo 1. Bu protokolde tanıtılan peptitler.

BELEDIYESI Serisi

Protein Antijen Kaynağı	Peptit Epitop	Atama	sıra	MHC I Kısıtlaması
SV401 Büyük T Ag2	T Ag206-215	Site I	SAINNYAQKL	H-2Db
SV40 Büyük T Ag	T Ag223-231	Site II/III	CKGVNKEYL	H-2Db
SV40 Büyük T Ag	T Ag404-411	Site IV	VVYDFLKC	H-2Kb
SV40 Büyük T Ag	T Ag489-497	Site V	QGINNLDNL	H-2Db
HSV-13 Glikoprotein B	gB498-505*	gB498-505	SSIEFARL	H-2Kb
LCMV4 Glikoprotein	GP33-41*	GP33-41	KAVYNFATC	H-2Db
1Simian Virüsü 40
2Büyük Tümör Antijeni
3Herpes Simpleks Virüsü tip 1
4Lenfositik Koriomenenjit Virüsü
*alakasız bir peptit olarak kullanılır

Sonuçlar

Şekil 1: nTreg hücrelerinin varlığında veya yokluğunda T Ag türevi epitoplara karşı T_CD8 aracılı sitotoksisitenin temsili sitoflorimetrik analizi. CFSE ile diferansiyel olarak etiketlenen kontrol peptitleri, bölge I veya bölge IV ile darbeli hedef splenositler, saf bir farenin (sol panel), PBS enjekte edilmiş bir T Ag astarlı farenin (orta panel) ve bir PC61 (nti-CD25) enjekte edilmiş (nTre...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 0.25 Tripsin-EDTA (1X)	Thermo Fisher Bilimsel	25200-056
ACK Lizing Tamponu	Thermo Fisher Bilimsel	A1049201
Anti-fare CD25 (klon PC-61.5.3)	Biyo X Hücresi	BE0012
Anti-fare PD-1 (klon RMP1-14)	Biyo X Hücresi	BE0146
CFSE (Mali İşler T	Thermo Fisher Bilimsel	C34554
DMEM (1X)	Thermo Fisher Bilimsel	11965-092
Fetal sığır serumu (FBS)	Wisent Biyoürünleri	080-150	Kullanmadan önce ısıyı etkisiz hale getirin
GlutaMAX (100X)	Thermo Fisher Bilimsel	35050-061
HEPES (1M)	Thermo Fisher Bilimsel	15630080	10 mM nihai konsantrasyon
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100X)	Thermo Fisher Bilimsel	11140-050
Penisilin / Streptomisin	Sigma-Aldrich	P0781 Serisi	Stok 100X
Sıçan IgG1 (klon KLH/G1-2-2)	Güney Biyoteknoloji	0116-01	İzotip kontrolü
Sıçan IgG1 (klon HRPN)	Biyo X Hücresi	BE0088	İzotip kontrolü
Sıçan IgG1 (klon TNP6A7)	Biyo X Hücresi	BP0290	İzotip kontrolü
Sıçan IgG2a (klon 2A3)	Biyo X Hücresi	BP0089	İzotip kontrolü
dev/dak 1640 (1 kat)	Thermo Fisher Bilimsel	11875-093
Sodyum Piruvat (100 mM)	Thermo Fisher Bilimsel	11360-070	1 mM nihai konsantrasyon

Serisi Serisi Serisi arası Gazetesi Serisi Serisi Serisi