Fagozom Oluşumu ve Kapanışının TIRF Mikroskobu Tabanlı Görselleştirilmesi

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

Not: Lifeact-mCherry'de kullanılan plazmit, Paris'teki Institut Curie'den Dr. Guillaume Montagnac'ın nazik bir hediyesidir.

1. Hücreler ve Transfeksiyon

Not: RAW264.7 makrofajları, 100 mm'lik bir plakada tam ortamda (RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 ortam, 10 mM HEPES, 1 mM sodyum piruvat, 50 μM β-merkaptoetanol, 2 mM L-Glutamin ve %10 FCS (Fetal Buzağı Serumu)) alt birleşim noktasına kadar büyütülür. Elektroporasyon ile floresan etiketli proteinleri kodlayan plazmitlerle transfekte edilirler. Rutin olarak, yaklaşık 5 - 6 x 10⁶ hücre, her transfeksiyon veya ko-transfeksiyon için sırasıyla 20 μg veya 10 μg plazmit ile transfekte edilir. Elektroporasyon veya lipofeksiyona dayalı diğer transfeksiyon yöntemlerinin alternatif yaklaşımlar olarak kullanılabileceğini unutmayın.

1. Hücreleri bir hücre kaldırıcı ile kazıyın ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek 10 ml kültür ortamında yeniden süspanse edin.
2. Hücre süspansiyonunu 300 x g, RT'de 5 dakika sallanan açılı rotorda santrifüjleyin.
3. 37 ° C'de 10 μg / ml gentamisin ile desteklenmiş 10 ml tam ortamı önceden ısıtın.
4. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı atın ve peleti elektroporasyon kitinden 3 ml "yıkama tamponu A" içinde yeniden süspanse edin.
5. Hücre süspansiyonunu 300 x g, oda sıcaklığında 5 dakika sallanan açılı rotorda santrifüjleyin.
6. Bu arada DNA karışımını oda sıcaklığında hazırlayın: 120 μl 2x Tampon B, ilgilenilen proteini kodlayan 20 μg plazmit DNA, q.s.p. 240 μl H₂O.
7. Santrifüjlemenin ardından, tüm süpernatanı atın.
8. DNA karışımındaki hücre peletini yeniden süspanse edin ve 4 mm'lik elektroporasyon küvetlerine aktarın.
9. RT'de 3 dakika inkübe edin.
10. 250 V, 900 μF'de elektroporasyon.
11. Hücreleri önceden ısıtılmış (37 ° C) gentamisin ile takviye edilmiş tam ortamda hemen yeniden süspanse edin ve 100 mm'lik bir tabağa koyun.
12. Transfekte edilmiş hücreleri gece boyunca 37 °C,% 5 CO_2'de inkübe edin.
13. Ertesi sabah, tam ortamı 10 ml serumsuz mikroskopi ortamı ile değiştirin (fenol kırmızısı içermeyen RPMI 1640, 10 mM HEPES, 1 mM sodyum piruvat, 50 μM β-merkaptoetanol, 2 mM L-Glutamin).

2. Kırmızı Kan Hücrelerinin Opsonizasyonu

Not: Makrofajlar için partikül hedef modeli olarak koyun kırmızı kan hücreleri (SRBC'ler) kullanılır. Genellikle, 35 mm cam tabanlı çanak başına yaklaşık 7 x^{10 6} SRBC kullanılır.

1. SRBC'leri 100 μl 1x PBS (fosfat tamponlu salin) /% 0.1 BSA (sığır serum albümini) ve santrifüj (600 x g, 4 dakika) ile yıkayın.
2. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı atın ve SRBC'leri 100 μl 1x PBS /% 0.1 BSA ve santrifüjde (600 x g, 4 dakika) yeniden süspanse edin.
3. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı atın ve SRBC'leri alt aglütinasyon konsantrasyonunda tavşan IgG anti-SRBC'ler ile 1x PBS /% 0.1 BSA'da yeniden süspanse edin. Antikor içeren 500 μl çözelti / 5 μl SRBC kullanın.
   not: Antikorların alt aglütine edici konsantrasyonu, bir ağ oluşumu olarak tespit edilen aglütinasyonu indüklemeyen en düşük konsantrasyona karşılık gelir. Genel olarak, alt aglütinasyon konsantrasyonu 8.2 μg/ml'dir.
   1. Bir hemaglutinasyon testi ile SRBC'leri opsonize etmek için gereken IgG anti-SRBC'lerin konsantrasyonunu belirleyin. IgG anti-SRBC'leri (13.1 mg / ml'de stok) bir mikroplaka içinde 1/50 - 1/25.600 arasında seri olarak seyreltin. Her kuyucuğa 2 x 10⁶ SRBC ekleyin. Plakayı karanlıkta RT'de birkaç saat inkübe edin.
4. Yavaş dönüşle RT'de 30 dakika inkübe edin.
5. Yukarıda tarif edildiği gibi 1x PBS /% 0.1 BSA'da iki yıkamadan sonra, IgG-opsonize SRBC'leri (IgG-SRBC'ler) önceden ısıtılmış serumsuz mikroskopi ortamında (2 ml / tabak) yeniden süspanse edin.

3. Lamellerin Poli-lizin Kaplaması

1. Bu arada, 35 mm cam tabanlı tabaklara oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 2 ml% 0.01 poli-L-lizin uygulayın.
2. Bulaşıkları 2 ml 1x PBS ile iki kez yıkayın.

4. SRBC'lerin Cam Tabanlı Tabaklara Kovalent Olmayan Fiksasyonu

1. 35 mm cam tabanlı tabak başına 2 ml SRBC süspansiyonu dökün.
2. 35 mm cam tabanlı tabaklara 2 dakika boyunca 500 x g'da sallanan bir rotor ile santrifüjleyin.
3. Süpernatanı çıkarın ve 2 ml 1x PBS /% 10 BSA ile bir kez yıkayın.
4. Parçacıkları tabak başına 2 ml 1x PBS /% 10 BSA ile 30 dakika inkübe edin.
5. Bulaşıkları 2 ml 1x PBS ile üç kez yıkayın.
6. 1x PBS'yi 2 ml önceden ısıtılmış (37 °C) serumsuz mikroskopi ortamı ile değiştirin.

5. TIRFM Tarafından Görselleştirilen Fagositoz

1. Mikroskop
   not: TIRFM, yağa daldırma objektifi (N 100X, NA1.49), CO_2'li bir ısıtma odası ve 1.5X lens ile birleştirilmiş iki tek foton algılama kamerası EMCCD (Elektron Çarpma Şarjı Birleştirilmiş Cihaz) ile donatılmış bir mikroskop kullanılarak gerçekleştirildi.
   1. TIRF mikroskop seansından bir gün önce, mikroskop aşamasının homojen bir şekilde ısınmasını sağlamak için ısıtma odasını 37 ºC'de açın.
2. Kritik Açı Belirleme
   not: ImageJ Color Profiler yazılımı, TIRF görüntü akışlarını işlemek için kullanılır.
   1. Mikroskop altına serum içermeyen mikroskopi ortamı ile opsonize SRBC içeren 35 mm'lik bir cam tabanlı tabak yerleştirin.
   2. Hücreleri kazıyın ve tabağa (100 - 500 μl) eklemeden önce ortamda tekrar süspanse edin.
   3. Mikroskobu kontrol etmek ve floresan etiketli proteinleri ifade eden hücreleri tanımlamak için 491 nm ve/veya 561 nm lazerle uyarma yapmak için "Live Acquisition" yazılımını kullanın.
   4. Floresan etiketli proteinleri ifade eden bir hücreyi tanımlayın.
   5. Alanın ortasına yerleştirin ve 0,01º'lik bir artışla 0º'den 5º'ye kadar farklı açılarla tek bir uyarma dalga boyunda 500 görüntü elde edin (Şekil 1A). Açılar mikroskop sistemi tarafından otomatik olarak değiştirilir.
   6. Gelen ışığın cam / ortam arayüzünde tamamen yansıtılmasına izin veren kritik açıyı belirleyin ve buharlaşan dalgayı oluşturun. ImageJ Color Profiler yazılımını kullanarak, "Dosya", "Aç"a tıklayarak görüntü dizisini açın ve dosyayı seçin.
   7. Dikdörtgen aletle, hücrede düzgün bir floresan ile bir ilgi alanı (ROI) seçin (Şekil 1B sarı 1).
   8. "Görüntü" sekmesine, açılır menüdeki "Yığınlar"a ve "Z ekseni Profilini Çiz"e tıklayarak x ekseni üzerindeki açıların fonksiyonu ile ROI'de ölçülen "Z ekseni profili" ortalama floresan yoğunluğunu çizin (Şekil 1B kırmızı 2).
      Not: Kritik açı, floresansta keskin bir azalmadan önce maksimum floresansa giden açıdır.
   9. Örnek 2.00'deki gibi bir TIRF sinyali elde etmek için mikroskopi oturumu sırasında x ekseninde kritik açıdan daha üstün herhangi bir açı değeri kullanın (Şekil 1C).
3. Satın alma
   1. Canlı Alım yazılımını kullanarak, "Protokol Düzenleyici" modülü ile edinim parametrelerini ayarlayın (Şekil 2A).
      1. TIRF bölgesindeki ilgili proteinlerden floresan sinyali elde etmek için "Çok Kanallı" edinimi içeren bir "döngü" ile bir protokol oluşturun. TIRF açısını (örneğin 2.00), maruz kalma süresini (örneğin 50 milisaniye) ve lazer yoğunluğunu (örneğin %50) girin (Şekil 2B 1).
      2. "Çoklu Kanallar" aracıyla epifloresanda sinyal alımı elde etmek için TIRF bölgesinin 3 μm üzerinde objektifin bir "Z hareketi" uygulayın. Kritik açının (örnek 1.00), pozlama süresinin (50 msn) ve lazer yoğunluğunun (%50) altına bir açı girin (Şekil 2B, 2 ve 3).
      3. Ardından, TIRF bölgesine geri dönmek için aşağıdaki hedef 3 μm'nin bir "z hareketini" ekleyin (Şekil 3B 4). Parlak ışıklı LED'de (Işık Yayan Diyot) hücrenin bir "anlık görüntüsünü" ekleyin (Şekil 2B 5).
   2. Partikülün etrafındaki plazma zarını genişleterek SRBC'nin fagositozunu başlatan orta düzeyde floresan etiketli protein ekspresyonuna sahip bir ilgi hücresi bulun.
   3. Alanın ortasına yerleştirin.
   4. 500 - 1.000 karelik akış alımına başlayın. "Döngü sayısı" sekmesine "750 kare" girin (Şekil 2B 1).
      not: ImageJ Color Profiler yazılımı, TIRF görüntü akışlarını işlemek için kullanılır.
   5. "Dosya", "Aç"a tıklayarak ve dosyayı seçerek dizi görüntülerini Image J yazılımında açın.
   6. "Görüntü ", "Hyperstacks" açılır menüsüne ve "Hyperstack'e yığınla" işlevine tıklayarak kanalları ayırın. Görünen pencereyi tamamlayın: Sipariş: xyctz; Kanal (c): kanal sayısı (ör: iki florokromunuz varsa "2"); Dilimler (z): z eksenindeki dilim sayısı (örn: z ekseninde hareket yoksa "1"); Çerçeveler (t): kanal sayısına bölünen görüntü sayısı; Ekran modu: Grayscale.
      not: İki farklı kanala karşılık gelen iki ayrı görüntü dizisi oluşturulur.

Şekil 1. TIRFM tarafından analiz edilen "fagozom kapanma testinin" şematik gösterimi. Fagozom kapatma testi, bir veya iki floresan etiketli proteini geçici olarak eksprese eden makrofajlar kullanılarak gerçekleştirilir. Makrofajlar, poli-lizin kaplı lameller üzerine kovalent olmayan bir şekilde sabitlenmiş IgG-opsonize SRBC'ler üzerinde biriktirilir. Görüntüler, fagozom kapanma bölgesini tespit etmek için TIRF modunda ve fagositik kabın tabanını tespit etmek için epifloresan modunda kaydedilir.

Şekil 2: TIRFM için kritik açının belirlenmesi. (Bir) "Canlı edinim" kullanılarak, floresan etiketli proteinleri ifade eden bir hücre, alanın ortasına yerleştirilir (kırmızı bölge 1). TIRF Yığını seçeneğiyle, görüntüler 0°'den 5°'ye kadar farklı açılarla, 0,01°'lik bir artışla (kırmızı bölge 2) tek bir uyarma dalga boyunda elde edildi. (B) Görüntü dizisi ImageJ Color Profiler yazılımı kullanılarak açılır ve ilgilenilen bir bölgenin ortalama floresan yoğunluğu (ROI), "Yığınlar" ve "PlotZ eksen profili" (kırmızı bölge 1) kullanılarak x ekseni üzerindeki açıların fonksiyonu ile çizilir. (C) Çizim üzerindeki floresan tepe noktasının x konumu kritik açıya karşılık gelir: 1.98° (siyah noktalı çizgi). Bu açıdan sonraki herhangi bir değer kullanılabilir. Örnek olarak, 2.00° seçilebilir (kırmızı çizgi).

Şekil 3. Canlı Edinim Modülünü Kullanarak İş Akışı Süreci: "Protokol Düzenleyici". (Bir) "Protokol Düzenleyicisi" penceresinde bir iş akışı tuvali oluşturulur. (B) Bu protokol, mikroskobun kullanıcı tarafından kararlaştırılan sayıda tekrarlayacağı bir eylem "Döngüsü" içerir. Örnek olarak: 750 (1). Bir döngü şunları içeriyordu: TIRF modunda ilgilenilen floresan proteinlerin lazerle uyarılması ile "Çok Kanallı" alımı. Örnek olarak: Lazer 491 nm yoğunluk P -TIRF açısı 2.00 (2); Objektifin "Z hareketi" 3 μm (3); Epifloresan modunda "Çoklu Kanallar" alımı (4); Objektifin TIRF bölgesine "Z hareketi" (5) ve iletilen ışıkta bir "Anlık Görüntü" (6).