Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
>1. İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin (PBMC'ler) Yoğunluk Gradyan İzolasyonu
- 25 ml'lik bir pipet ile 50 ml'lik bir tüpe 25 ml heparinize tam kan ekleyin.
- Hücreleri 25 ml fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltin.
- 50 ml'lik yeni bir tüpe 15 ml Ficoll-Paque yoğunluk gradyanı ekleyin ve tüpü eğerken, yoğunluk gradyanı üzerine çok yavaş ve dikkatli bir şekilde 25 ml seyreltilmiş hücre süspansiyonu ekleyin, böylece tam kanın yoğunluk gradyanı ile karışması olmaz, yani kan yoğunluğu gradyanı arayüzünde herhangi bir bozulma olmaz.
- Süspansiyonu 1.2. adımdan itibaren 400 × g'da 30 ila 40 dakika boyunca 20 °C'de frensiz sıcaklık kontrollü döner kova rotorunda santrifüjleyin.
not: Santrifüjlemeden sonra üç farklı katman belirgin olmalıdır: üst katman plazmadır; alt şeffaf katman Ficoll-Paque yoğunluk gradyanıdır; ve PBMC'ler olan ince, orta hücresel bir katman.
- Mononükleer hücrelerin (yani lenfositler, monositler ve trombositler) interfaz tabakasını rahatsız etmemeye dikkat ederek bir Pasteur pipeti ile emerek üst tabakayı aspire edin ve atın.
- Bu mononükleer hücre tabakasını 10 ml'lik bir pipetle 50 ml'lik yeni bir santrifüj tüpüne dikkatlice toplayın.
- Tüpü 20 ml PBS ile doldurun, iyice karıştırın ve 20 ° C'de 10 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra süpernatanı tamamen çıkarın.
- Hücre peletini 20 ml PBS içinde yeniden süspanse edin ve 20 × g'da 20 ° C'de 10-15 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra süpernatanı tamamen çıkarın.
not: Bu adım, PBMC'ler içinde istenmeyen trombositleri uzaklaştırır; Trombositlerin tamamen çıkarılmasını sağlamak için bu adım tekrarlanabilir.
- Belirli popülasyonların seçilmesi istenmiyorsa, bir sonraki adıma geçmeden önce 107 PBMC başına 1 ml besiyerini askıya almak için bir hücre sayımı yaptıktan sonra kültür için lökosit tam ortamında (% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 L-glutamin ve% 1 penisilin / streptomisin RPMI-1640 ortamında hücre peletini yeniden süspanse
edin.
2. Lökosit Popülasyonlarının Manyetik Etiketlenmesi
- PBMC süspansiyonunu 10 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı tamamen aspire edin.
- Hücre peletini 107 toplam hücre başına 80 μl PBS'de yeniden süspanse edin.
- 107 toplam hücre başına 20 μl belirtilen manyetik boncuk (yani, monositlerin izolasyonu için CD14 manyetik boncuklar, T lenfositlerin izolasyonu için CD4 manyetik boncuklar) ekleyin.
- İyice karıştırın ve buzdolabında 2 ila 8 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
- Yıkamak için 107 hücre başına 1-2 ml PBS ekleyin ve 10 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı tamamen aspire edin ve 500 μl PBS'de 108 hücreye kadar yeniden süspanse edin.
3. Lökosit Alt Popülasyonlarının Manyetik Seçimi
Not: Belirli lökosit popülasyonunun bir dizi üreticiden hücre yüzeyi işaretleyicisi ile izolasyonu için çeşitli manyetik boncuk ayırıcılar ve sütunlar mevcuttur. İzolasyon, bir veya birkaç pozitif belirteçte dayalı pozitif seçim veya istenmeyen popülasyonların tükenmesinden sonra negatif seçim ile olabilir. Bir belirteç (yani, T yardımcı lenfositleri için CD4 veya monositler için CD14) kullanarak pozitif seçim gerçekleştirmenin genel bir yaklaşımı aşağıda özetlenmiştir.
- Ayırma sütunu da dahil olmak üzere manyetik ayırıcıyı üreticinin talimatlarına göre hazırlayın ve astarlayın.
- Etiketli PBMC'lerin örneğini içeren tüpü uygulayın. Üreticinin talimatlarını izleyerek, pozitif etiketli ve etiketsiz hücre fraksiyonlarının toplanması için iki adet 15 ml'lik santrifüj tüpü sağlayın.
- Hücre sayısını sayın ve pozitif olarak seçilen lökositleri (yani, CD4 + T lenfositleri veya CD14 + hücreleri) lökosit tam ortamında, 107 hücre başına 1 ml ortam kullanarak yeniden süspanse edin.
4. Proliferasyonun Değerlendirilmesi için Lökositlerin Karboksifloresein süksinimidil ester (CFSE) Boyanması
Not: CFSE, hem in vivo hem de in vitro çalışmalar için immünolojik araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Protokolümüz, MSC/PBMC (veya diğer lökosit) etkileşimlerinin in vitro çalışması için optimize edilmiştir. CFSE in vitro etiketlemenin yürütülmesinde yer alan genel adımlar benzer olsa da, protokolün spesifik dozu ve zamanlamasında farklılıklar olabilir. Bu, bir dizi faktöre bağlı olabilir, yani kullanılan spesifik hücre tipi, kullanılan hücre numaraları - bu muhtemelen CFSE floresan sinyalinin yoğunluğunu etkileyebilir.
- CFSE stok çözeltisini (10 mM) PBS'de istenen 10 μM çalışma konsantrasyonuna (CFSE çalışma çözeltisi) seyreltin. CFSE çalışma solüsyonu ile etiketlemek için 107 hücre (yani PBMC'ler veya T hücreleri) hazırlayın.
- Bir hücre peleti elde etmek için 300 × g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin.
- Hücreleri 1 ml önceden ısıtılmış (37 ° C) CFSE çalışma solüsyonunda nazikçe yeniden süspanse edin ve hücreleri 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
- Fazla CFSE'yi yıkamak için, hücre süspansiyonunu %10 FBS içeren 10x (hacimce) önceden soğutulmuş (4 °C) RPMI ortamı ile seyreltin. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme ile çökeltin ve süpernatanı atın. Hücre peletini bu şekilde iki kez daha yıkayın.
- Hücreleri santrifüjleme ile yeniden pelet yapın ve hücre sayısını sayın. 10ml taze önceden ısıtılmış lökosit tam ortamında 1 7 hücreyi (PBMC'ler veya T hücreleri) yeniden süspanse edin.
5. Efektör Bastırma Testi Manyetik Boncuk ile seçilmiş, MSC ile İndüklenen İmmünomodülatör Lökositler Aktive Edilmiş CFSE etiketli Efektör CD4 + T Hücreleri
- 37 ° C'lik bir inkübatörde O / N bağlantısı için 6 oyuklu plakalarda (MSC yoğunluğu: 25.000 hücre /cm2) 3 ml MSC tam ortamında 250.000 hücrede tohum MSC'leri, kök hücrelerin% 80 birleşmesine ulaşmasını sağlar. Alt popülasyon seçimi için yeterli MSC kokültüre edilmiş PBMC'leri sağlamak için en az 3 adet 6 oyuklu plaka gereklidir.
- Ortamı aspire edin ve Adım 1'e göre ayrılmış, ancak 3 ml lökosit tam ortamı ile 2.5 x 106 hücre / oyukta (hücre yoğunluğu: 250.000 lökosit /cm2) 6 oyuklu plakalara PBMC'leri ekleyin. 37 ° C'lik bir inkübatörde 48-72 saat boyunca ko-kültür.
- MSC ile indüklenen immünomodülatör lökositlerin (yani, CD14 + hücreleri) manyetik boncuk seçimi spesifik popülasyonu Bölüm 2-3.
göre
not: Akış sitometrik analizi için hücre içi sitokin boyama, lökosit sitokin ekspresyon profilindeki değişiklikleri, yani MSC'ler tarafından modüle edilen interlökin-10-ekspresyonunu değerlendirmek için bu noktada gerçekleştirilebilir.
- 1 ml lökosit tam ortamında (T hücre yoğunluğu: 250.000 hücre /cm2) 24 oyuklu plakalarda Bölüm 2-4'e göre üretilen CFSE etiketli allojenik CD4 + T hücrelerini, boncukla seçilmiş MSC ile indüklenmiş lökositlere çeşitli oranlarda, yani 1: 10, 1: 5, 1: 2 ve 1: 1 (hücreden hücreye) oranlarında.
- CD4 + T hücrelerini uyarmak için, 1: 1'lik bir boncuk-hücre oranı elde etmek için α-CD3 / 28 konjuge mikro boncuklar ekleyin.
- Negatif bir kontrol için, 24 oyuklu bir plakada (T hücresi yoğunluğu: 250.000 hücre /cm2) sadece 1 ml lökosit tam ortamı ile 500.000 CD4 + T hücresi / kuyucuğu plakalayın; pozitif kontrol için, aynı sayıda CD4 + T hücresi / oyuğu kaplamaya ek olarak, 1: 1'lik bir boncuk-hücre oranı elde etmek için α-CD3 / 28 konjuge mikro boncuk ekleyin.
- Ko-kültürün 3. gününde, CFSE etiketli CD4 + T hücrelerinin (yuvarlak tabanlı tüplere yerleştirilmiş) proliferasyonunu, 488 nm uyarma ve floresein için uygun emisyon filtreleri ile akış sitometrik analizi ile değerlendirin.