Stromal Hücrelerin Lökosit Alımı Üzerindeki Etkisinin İn Vitro Flow Araştırması

Özet

Kaynak: Munir, H. et al., Stromal Hücrelerin Akıştan Lökosit Alımı Üzerindeki Etkilerinin İncelenmesi. J. Vis. Uzm.(2015)

Video, stromal hücrelerin lökosit alımı üzerindeki etkisini araştırmak için bir yöntem göstermektedir. Paralel bir plaka akış odası modelinde, pro-inflamatuar sitokinler, endotel hücreleri tarafından adezyon reseptörlerinin ekspresyonunu indükleyerek nötrofil alımını ve göçünü kolaylaştırır. Stromal hücreler ve endotel hücreleri arasındaki çapraz konuşma, endotel hücrelerine nötrofil alımını azaltır.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Primer İnsan Endotel Hücreleri ve Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Kültürü

1. İnsan umbilikal ven endotel hücrelerinin (HUVEC) izolasyonu ve kültürü:
   1. Göbek kordonunu kağıt havlu serilmiş bir tepsiye koyun ve üzerine %70 etanol püskürtün. Bir doku kültürü başlığına yerleştirin. Damarı tanımlayın ve her iki uçta kanül yapın. Sabitlemek için kanüllü ucun etrafına bir kablo bağı yerleştirin.
   2. Bir şırınga kullanarak venöz kanı fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Şırıngayı hava ile doldurun ve kalan PBS'yi çıkarmak ve atmak için damardan geçirin.
   3. 10 mg / ml kollajenaz tip Ia'yı çözün ve PBS'de (kalsiyum ve magnezyum klorür ile) 1 mg / ml'lik bir nihai konsantrasyona kadar 1:10 oranında seyreltin. Her iki kanül de dolana kadar kollajenaz solüsyonunu damar içine geçirin. Her iki ucundaki kanüllerdeki kelepçeleri kapatın.
   4. Tepsiyi mendille örtün ve %70 etanol püskürtün. Kabloyu 37 °C ve %5 karbondioksitte (CO₂) 20 dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin.
   5. Kabloyu inkübatörden çıkarın ve kablo bağlarını sıkın. Kabloya 1 dakika boyunca nazikçe masaj yapın. Hücre süspansiyonunu 10 ml PBS ile yıkayın ve 50 ml'lik bir santrifüj tüpünde toplayın.
   6. Şırıngayı hava ile doldurun ve kalan PBS'yi iki kez çıkarmak için damardan geçirin, PBS'yi adım 1.1.5'te kullanılan 50 ml'lik bir santrifüj tüpünde toplayın. Oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
   7. Süpernatanı aspire edin ve peleti 1 ml tam endotel hücre (EC) ortamında yeniden süspanse edin. EC besiyeri, 35 μg/ml gentamisin sülfat, 10 ng/ml insan epidermal büyüme faktörü, 1 μg/ml hidrokortizon, 2.5 μg/ml amfoterisin B ve %20 fetal buzağı serumu ile desteklenmiş M199'dan oluşur.
   8. 25 cm2'lik bir şişeye 4 ml EC besiyeri ve EC süspansiyonu ekleyin. Ortamı ertesi gün ve ardından her 2 günde bir değiştirin.
   9. EC'ler parke taşı benzeri bir morfoloji sergiler (Şekil 1Ai). Yapışma deneyleri için, EC'ler genellikle %100 birleşmeye ulaştıklarında tohumlanır (bakınız Bölüm 1.4).
2. Wharton'un jöle mezenkimal kök hücrelerinin (WJMSC) insan göbek kordonlarından izolasyonu:
   1. Wharton'un jöle türevli MSC'sini (WJMSC) taze göbek kordonlarından veya EC'yi izole etmek için daha önce kullanılmış olan kordonlardan izole edin. Göbek kordonunu 5 cm uzunluğunda parçalar halinde kesin. Kan damarlarını ortaya çıkarmak için her parçayı uzunlamasına kesin (2 arter [beyaz, sert] ve 1 damar [sarı, şişkin]).
   2. Steril makas ve forseps kullanarak kan damarlarını çıkarın ve atın. Tüm dokuyu 2 - 3 mm³ parçaya kesin. Forseps kullanarak 2 - 3 mm³ parçayı 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
   3. 100 mg / ml stok kollajenaz tip II'yi çözün ve 10 ml PBS'de 1:100'ü 1 mg / ml'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. 20.000 U / ml stok hyaluronidazı çözün ve kollajenaz çözeltisinde 1:400'ü 50 U / ml'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin.
   4. Doku parçalarını içeren santrifüj tüpüne enzimatik bir kokteyl ekleyin. Doku parçalarını yavaş bir döndürücü üzerinde 37 ° C'de 5 saat inkübe edin.
   5. Hücre süspansiyonunu PBS'de 1:5 oranında seyreltin. 100 μm'lik bir gözenekli filtreyi 50 ml'lik yeni bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Hücre süspansiyonunu 100 μm gözenekli filtreye dökün.
      not: Kalan doku parçaları filtrede tutulacak ve hücreler 50 ml'lik santrifüj tüpünde toplanacaktır.
   6. Filtreyi atın. Hücre süspansiyonunu RT'de 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve WJMSC peletini 12 ml tam WJMSC kültür ortamında (Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı, DMEM düşük glikoz,% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ve 100 U / ml penisilin + 100 μg / ml streptomisin karışımı) yeniden süspanse edin.
   7. Tüm hücreleri 75^cm2'lik bir doku kültürü şişesine tohumlayın. Ortamı 24 saat sonra 12 ml tam WJMSC kültür ortamı ile değiştirin. Ortamı her 2-3 günde bir değiştirin. Hücreler 2 hafta içinde% 70 - 80 birleşmeye ulaşmalıdır. WJMSC %70 - 80 birleşmeye ulaştığında geçiş (bkz. Bölüm 1.4).
3. Kemik iliği kaynaklı MSC'nin (BMMSC) genişletilmesi:
   1. Daha önce tarif edildiği gibi insan kemik iliğinden türetilmiş MSC'yi (BMMSC) izole edin. 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne 10 ml önceden ısıtılmış mezenkimal kök hücre, MSC büyüme ortamı (MSCGM) ekleyin.
   2. 37 ° C'lik bir su banyosuna 2 dakika boyunca yerleştirerek bir p2 BMMSC şişesini çözdürün. BMMSC süspansiyonunu MSCGM içeren santrifüj tüpüne ekleyin. Pipetleyerek iyice karıştırın.
   3. RT'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen aspire edin.
   4. Hücreleri 1 ml MSCGM'de yeniden askıya alın ve bir hemositometre veya hücreölçer gibi bir dijital hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
   5. Tohum hücreleri, 12 ml MSCGM'de cm^başına 5.000 - 6.000 hücre yoğunluğunda 75 cm2 kültür şişelerine tohumlayın. Ortamı 24 saat sonra 12 ml MSCGM ile değiştirin. Hücreleri her 2-3 günde bir 12 ml MSCGM ile besleyin.
   6. BMMSC %70 - 80 birleşmeye ulaştığında geçiş (bkz. Bölüm 1.4). Hücreler fibroblastik bir morfoloji sergiler (Şekil 1Aii).
4. EC ve MSC'nin ayrılması:
   1. 25 cm'den aspire ortamı² kültür şişeleri. Yaklaşık 2 dakika boyunca 2 ml %0.02 etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin. EDTA'yı aspire edin ve 2 ml tripsin (2.5 mg / ml) ekleyin. Hücreler yuvarlak hale gelene kadar mikroskop altında görüntüleyin.
   2. Hücreleri ayırmak için şişeye dokunun. 8 ml kültür ortamı ekleyerek tripsini inaktive edin (hücre tipine bağlı olarak; HUVEC için EC ortamı, WJMSC için DMEM LG ve BMMSC için MSCGM) kültür şişesine aktarın ve süspansiyonu 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
   3. RT'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve peleti aşağıda açıklandığı gibi yeniden süspanse edin.
      1. MSC'nin geçirilmesi için, peleti 3 ml'lik bir kültür ortamında yeniden süspanse edin. 11 ml kültür ortamını üç ayrı 75^cm2 kültür şişesine ekleyin. Her kültür şişesine 1 ml hücre süspansiyonu ekleyin (1: 3 bölünmüş). Ko-kültür tahlillerinde kullanmadan önce WJMSC ve BMMSC'yi 3 kez (p3) geçin.
      2. Yapışma deneylerinde EC veya MSC'nin tohumlanması için – Bölüm 2 ve 3'e bakınız.
5. MSC'nin dondurulması:
   1. Geçit 3'te, Bölüm 1.4'te açıklandığı gibi MSC'yi ayırın. Süpernatanı aspire edin ve 3 ml buz gibi soğuk CryoSFM'de yeniden süspanse edin. 1.5 ml buz gibi soğuk kriyoviyallere 1 ml hücre süspansiyonu pipetleyin. Kriyovialleri dondurucu bir kaba koyun.
   2. Kabı -80 °C O/N'de saklayın. Sıvı nitrojene aktarın. Bir MSC şişesini çözdürün (1.3.1 - 1.3.6 adımlarını izleyin). MSC'yi 5 ml'lik bir kültür ortamında yeniden süspanse edin (WJMSC veya BMMSC için uygun ortamı seçin) ve 25^cm2'lik bir şişeye tohumlayın.

2. Filtreler Üzerinde Endotelyal-Mezenkimal Kök Hücre Ko-kültürlerinin Kurulması

1. WJ veya BMMSC'yi Bölüm 1.4'te açıklandığı gibi ayırın. Peleti 1 ml MSCGM'de tekrar süspanse edin. Bir hemositometre veya hücreölçer kullanarak hücre sayımı yapın.
2. Ses seviyesini, nihai konsantrasyon 500 μl MSCGM'de 5 x 10⁵ MSC olacak şekilde ayarlayın.
3. Steril forseps kullanarak 6 kuyulu, 0,4 μm PET Transwell filtrelerini ters çevirin ve steril bir kutuya yerleştirin.
4. Filtrelerin dış yüzeyine 5 x 10⁵ MSC tohumlayın. Filtreleri 37 °C ve %5_CO2'de 1 saat inkübe edin.
5. Filtrenin dış yüzeyinden ortam toplayın. Medyadaki bağlı olmayan MSC'lerin sayısını sayın. Steril forseps kullanarak filtreleri yeniden ters çevirin ve bunları 3 ml MSCGM içeren eşleşen 6 oyuklu bir plakaya yerleştirin.
6. Filtrenin iç yüzeyine 2 ml MSCGM ekleyin (Şekil 1B). 24 saat boyunca 37 ° C ve% 5 CO_2'de bir inkübatöre yerleştirin. Birleşen 25^cm2'lik bir EC şişesini tripsinize edin (Şekil 1Ai; Bölüm 1.4 olarak).
7. EC'yi 8 ml MSCGM'de yeniden süspanse edin (1 x 25 cm² şişe, dört adet 6 oyuklu filtreyi tohumlayacaktır; ~ 5 x 10⁵ EC / filtre). Gözenekli filtrelerin üstünden ve altından ortamı aspire edin. Alt hazneye (filtrenin altına) 3 ml taze MSCGM ekleyin. Her filtrenin iç yüzeyine 2 ml EC süspansiyonu ekleyin. 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de 1 saat inkübe edin.
8. Yapışmayan EC'yi yıkamak için ortamı aspire edin ve yeni MSCGM ile değiştirin. Önce MSC'yi tohumlamadan iç yüzeydeki hücreleri tohumlayarak paralel EC mono-kültür filtreleri kurun. O/N'yi 37 °C ve %5 CO_2'de inkübe edin.
9. EC tek katmanının birleşim halinde olduğunu ve boşluk içermediğini kontrol edin. Alt birleşen tek tabakalar yapışma testleri için kullanılamaz (Şekil 1B).
10. 1 x 10⁵ U / ml stok tümör nekroz faktörü-alfa'yı (TNFa) çözün ve MSCGM'de 1: 1.000'i 100 U / ml'lik bir nihai konsantrasyona (~ 10 ng / ml'ye eşdeğer) seyreltin. 10 U / ml elde etmek için 100 U / ml TNFa'yı MSCGM'de 1:10 oranında seyrelterek bir seri seyreltme gerçekleştirin. 1 U / ml elde etmek için 10 U / ml TNFa'yı MSCGM'de 1: 10 oranında seyreltin.
11. Filtrelerin üst ve alt odalarına, testten önce 4 saat boyunca 37 ° C'de 1, 10 veya 100 U / ml TNFα (~ 10 ng / ml'ye eşdeğer) ile muamele edin.

3. Lökositlerin İzolasyonu

1. Sağlıklı gönüllülerden venöz kan alın ve hemen EDTA tüplerine alın. Karıştırmak için tüpleri hafifçe ters çevirin.
2. 2.5 ml Histopaque 1077'yi 10 ml yuvarlak tabanlı bir tüpte 2.5 ml Histopaque 1119 üzerine katmanlayın. Histopaque gradyanı üzerine 5 ml tam kan katmanlayın. RT'de 40 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin.
3. Histopaque 1077 ve 1119'un arayüzünde (eritrosit tabakasının üzerinde) periferik polimorfonükleer nötrofilleri (PMN) hasat edin. 10 ml'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe yerleştirin ve PBSA ile 10 ml'ye kadar makyaj yapın. Tüpü yavaşça ters çevirin ve RT'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
4. % 7.5 BSA çözeltisi 1: 50'yi 100 ml PBS'de (kalsiyum ve magnezyum klorür ile)% 0.15'lik bir nihai konsantrasyona (a/h; PBSA) tarafından desteklenmektedir. Süpernatanı aspire edin ve 10 ml PBSA'da yeniden süspanse edin. RT'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
5. 1 ml PBSA'da tekrar süspansiyon haline getirin. Hücre süspansiyonunun 20 μl'lik bir alikotunu alın ve 380 μl PBSA'ya (1:20 seyreltme) ekleyin. Bir hemositometre veya hücreölçer kullanarak hücreleri sayın. PBSA'da gerekli konsantrasyona (Transwell filtreleri ve Ibidi microslide için 1 x 10⁶ / ml) seyreltin. Teste kadar RT'de nötrofil süspansiyonunu koruyun.

4. Akış Sisteminin Montajı

1. Akış sistemini Şekil 1C'de gösterildiği gibi kurun. Isıtıcıyı açın ve 37 °C'ye ayarlayın. 3 bir musluğa 20 ml'lik bir şırınga (pistonu çıkarın) ve 5 ml'lik bir şırınga takın. Mikro gözenekli bant kullanarak musluğu Perspex haznesine takın.
2. Valf ile 3 musluk arasındaki yaklaşık mesafe olan uzun bir silikon 2/4 mm (kalınlık) boru parçasını ölçün ve kesin. 8 - 10 mm uzunluğunda 1/3 mm (ince) bir boru parçası kesin ve kalın borunun bir ucuna yerleştirin. Kalın boru tarafını 3 musluğa takın.
3. İnce boru ucunu elektronik 3 mikro valfin bir portuna bağlayın. Bu "yıkama haznesi" dir. 6-8 mm uzunluğunda kalın ve ince bir boru parçası kesin.
4. İnce boruyu kalın borunun bir ucuna yerleştirin. Kalın boru ucunu 2 ml'lik bir şırıngaya takın (pistonu çıkarın).
5. "Numune haznesi" yapmak için 2 ml'lik şırınganın ince boru ucunu elektronik mikro valf üzerindeki bir bağlantı noktasına bağlayın. Mikrovalf ile mikroskop aşamasının merkezi arasındaki mesafe olan uzun bir ince boru parçasını ölçerek ve keserek valfi filtre akış odasına bağlayın.
6. Mikro slayt modeli için, ince borunun ucuna 8 - 10 mm'lik kalın bir boru parçası takın. Kalın borunun ucuna L şeklinde bir konektör yerleştirin. Bu, mikro slayta bağlanacaktır. Filtre modeli için, boruyu ince borunun ucuna bağlayan 8 - 10 mm'lik bir Portex Blue Line Manometre parçası takın.
7. İnce boru ucunu mikro valfin üzerine yerleştirin. Bu, yıkama ve numune rezervuarları için ortak çıktıdır. Rezervuarları PBSA ile doldurun. Hava kabarcıklarını gidermek için PBSA'yı içlerinden geçirerek boruları astarlayın.
8. Manometre hortumunu 29 mm (50 ml) cam şırıngaya takın. Şırıngayı 10 ml PBSA ile doldurarak astarlayın. Şırıngayı, boruya bağlı uç yukarı bakacak şekilde ters çevirin ve tüm hava kabarcıklarını dışarı itin. 5 ml PBSA ile tekrar doldurun.
9. Yalnızca mikro slayt modeli için, cam şırıngaya giden Manometre borusunun ucuna 10 - 12 mm kalınlığında bir boru parçası takın. Kalın borunun ucuna L şeklinde bir konektör yerleştirin. Cam şırıngayı infüzyon / çekme için bir şırınga pompasına yerleştirin.
10. Aşağıdaki formülleri kullanarak 0,1 Pa (Transwell filtreleri) veya 0,05 Pa (Ibidi mikro slaytları) istenen duvar kesme gerilimini (Pascal, Pa cinsinden τ_w) oluşturmak için gereken yeniden doldurma akış hızını (Q) hesaplayın:
    γ_w = (6. Q) / (w.h²)
    τ = n.γ
    Burada w = iç genişlik ve h = akış kanalının iç derinliği. n = akan çözeltinin viskozitesi; PBSA n = 0.7 mPa.s'dir. Paralel plakalı filtre akış odası için genişlik (w) 4 mm ve derinlik (h) 0.133 mm'dir. Haznenin derinliği, kullanılan Parafilm contasının kalınlığındaki farklılıklar nedeniyle biraz değişebilir. Ibidi microslide için genişlik 3,8 mm ve derinlik 0,4 mm'dir.
    not: Akış kanalının boyutlarındaki farklılıklar ve yakalama dinamikleri nedeniyle, mikro slayt modeli için filtre modeline kıyasla farklı kesme gerilmeleri kullanıyoruz.

5. Filtreleri İçeren Paralel Plakalı Akış Odasının Kurulması

1. Metal bir şablon kullanarak bir parça Parafilm (cam lamel ile aynı boyutta) kesin. Metal bir şablon kullanarak Parafilm'de (akış kanalını oluşturmak için) 20 x 4 mm'lik bir yuva kesin. Cam lamel üzerindeki akış kanalını işaretlemek için contayı kullanın.
2. 6 oyuklu filtrenin kenarlarını cam lamel üzerine hizalayın. Filtrenin akış kanalı işaretlerini kapattığından emin olun. 10A tipi bir neşter kullanarak filtreyi dikkatlice kesin.
3. Filtreyi bir Parafilm conta ile dikkatlice kapatın ve akış kanalı yuvasının filtrenin ortasında olduğundan emin olun (Şekil 1D). Bir parça temiz mendil kullanın ve baloncukları dışarı itin.
4. Lameli Perspex akış odasının alt plakasının girintisine yerleştirin. Üst Perspex plakasını contanın üstüne yerleştirin ve plakaları birbirine vidalayın (Şekil 1D).
5. Yıkama tamponunun (PBSA) valften akmasına izin vermek için 3 musluğu çevirin. Manometre borusunu üst Perspex plakasının giriş portuna bağlayın. Kabarcıkların geçmesine izin vermek için PBSA'yı akış kanalından geçirin.
6. Şırınga pompasından gelen Manometre borusunu Perspex plakasının çıkış portuna bağlayın. Şırınga pompasını yeniden doldurmak için ayarlayın ve çalıştır düğmesine basın. Haznenin üst plakasına damlayan PBSA'ları temizleyin.
7. Odayı ters çevrilmiş bir faz kontrast mikroskobu sahnesine yerleştirin. EC'yi filtrelerin üzerinde görselleştirmek için odağı ayarlayın (Şekil 1B).

6. Lökositlerin endotel hücreleri üzerine perfüzyonu

1. Numune haznesine 2 ml saflaştırılmış nötrofil koyun ve 2 dakika ısınmaya bırakın. Endotelyum'u PBSA ile 2 dakika yıkayın.
2. Nötrofilleri endotel üzerine perfüze etmek için valfi AÇIK konuma getirin. Nötrofil bolusunu 4 dakika boyunca verin. Valfi KAPALI konuma getirin ve deneyin geri kalanında PBSA'yı yıkama haznesinden boşaltın.
3. Tahlil sırasında herhangi bir noktada hava kabarcıklarının akış kanalından geçmediğinden emin olun, çünkü bu, EC tek tabakasını bozacak ve yapışan nötrofillerin ayrılmasına neden olacaktır.

7. Nötrofil Yakalama ve Davranışının Kaydedilmesi

1. Nötrofil akışı sırasında veya perfüzyon sonrası nötrofil alımını kaydedin.
2. Akış kanalının ortasındaki en az 5 - 10 alanın tüm dijital kayıtlarını yapın. Hedefi giriş portundaki kanalın kenarına hareket ettirerek ve portun ortasını belirleyerek kanalın merkezini belirleyin.
   1. Nötrofil akışı sırasında kayıt yapmak için, 1 dakika boyunca her 10 saniyede bir tek bir alanın görüntüsünü alın. Kanal boyunca ilerleyin ve 1 dakika boyunca başka bir alanı kaydedin. Bolus süresi boyunca tekrarlayın.
   2. Perfüzyon sonrası kayıt için, lökosit davranışını değerlendirmek için akış kanalının merkezinden aşağı doğru 5 - 10 alanın 10 saniyelik kayıtlarını yapın (tipik olarak nötrofil bolusunun bitiminden 2 dakika sonra). 10 saniyelik aralıkta her saniye fotoğraf çekin. Bu, akıştan yakalama ve yapışan nötrofillerin davranışının analiz edilmesi için yeterli zaman sağlar.
   3. Her 30 saniyede bir görüntü çekerek 5 dakika boyunca en az 10 göç etmiş nötrofil içeren tek bir alanı kaydedin. Bu, göç eden hücrelerin hızını hesaplamak için kullanılabilir (endotelin üstünde veya altında).
   4. Başka bir 10 saniyelik alan serisi kaydedin (genellikle perfüzyondan 9 dakika sonra). Bu, nötrofillerin endotelyal tek tabakadan geçme süresine izin verir.
   5. Şırınga pompasını durdurun ve hortumu çıkarın. Akış odasını sökün ve numune haznesini ve hortumunu durulayın. Sonraki filtreler/mikro slayt kanalları için tekrarlayın.

8. Lökosit Alımı ve Davranışının Analizi

1. 2 dakikalık zaman noktasında 10 saniyelik kayıtlar sırasında her alandaki nötrofil sayısını sayın. Sayılabilmesi için tüm hücrelerin ilk-ikinci alanda bulunması gerekir. Görüş alanının 2 tarafında (örn. üst/sağ kenarlık) kısmen alanda bulunan hücreler, tam 10 saniye boyunca alanda kaldıkları sürece sayımlara dahil edilir.
2. Alan başına ortalama yapışık nötrofil sayısını hesaplayın. Kaydedilen alanın uzunluğunu ve genişliğini ölçün. Alanın alanını hesaplayın. 1 mm'de kaç alan olduğunu hesaplayın². Ortalama nötrofil sayısını 1 mm2'deki alan sayısı ile çarpın.
3. Perfüze edilen nötrofil miktarını (örneğin, 2 x 10⁶/ml*Q [örneğin, paralel plaka akış odası için 0.0999 ml/dak]) bolus süresiyle çarparak perfüze edilen toplam nötrofil sayısını hesaplayın (örn., 4 dakika).
4. Nötrofil sayısını/^mm2'yi, yapışan toplam hücre sayısını belirlemek için perfüze edilen toplam nötrofil sayısına bölün (yapışık hücreler/mm² / 10,⁶ perfüze).
5. Yapışık nötrofillerin yuvarlanıp yuvarlanmadığını, sıkıca yapışıp yapışmadığını veya göç edip etmediğini değerlendirin.
   1. Yuvarlanan bir nötrofil faz parlaktır ve endotelyal tek tabaka (1 - 10 μm / sn) boyunca yavaşça hareket eder.
   2. Sıkıca yapışık hücreler faz parlaktır ve EC yüzeyine bağlıdır, ya sabit kalır (yani kayıt sırasında hareket etmez) ya da şekil değişikliğine uğramıştır ve EC yüzeyi üzerinden göç eder (Şekil 1Ei).
   3. Göç etmiş bir nötrofil faz karanlıktır ve EC tabakasının altındadır (Şekil 1Eii).
6. Yuvarlanan, durağan ve göç eden yapışık hücrelerin yüzdesini hesaplayın. Alternatif olarak, nötrofil davranışı, toplam yapışmayı hesaplamak için kullanılan aynı formülü uygulayarak (adım 8.6 - 8.7'de açıklandığı gibi) farklı davranışlar sergileyen toplam hücre sayıları olarak ifade edilebilir.
   1. Yuvarlanan bir nötrofilin ön kenarını işaretleyin. 10 saniyelik dizinin sonunda aynı hücrenin ön kenarını işaretleyin. 2 nokta arasına bir çizgi çizin ve hücrenin kat ettiği mesafeyi ölçün.
   2. Bu değeri, hücrenin yuvarlandığı kaydın süresine (yani 10 saniye) bölün. 10 saniyelik aralığın tamamı boyunca sahada bulunan nötrofilleri seçmeye çalışın.
7. Yüzey üzerinden (şekilli, değişmiş faz, parlak) veya endotelin altından (faz karanlık) göç eden nötrofillerin hızını hesaplamak için 5 dakikalık kaydı kullanın.
   1. Dizinin başında taşınan hücrelerin bir taslağını çizin ve dizi boyunca hareketlerini izleyin. Her hücre için her 1 dakikalık aralıklarla merkezin X ve Y konumlarını not edin. Dizinin ilk görüntüsündeki X ve Y konumlarının değerlerini ikinci görüntüdeki değerlerden çıkarın. Bu Pisagor teoremine dayanmaktadır.
   2. İkinci görüntüdeki değerleri üçüncü görüntüden çıkarın. Bunu dizideki tüm görüntüler için yapın. X ve Y değerlerinin karesini alın ve bunları toplayın.
   3. Elde edilen değerin karekökü. Her dakika aralığında hesaplanan hızların ortalamasını alarak her hücrenin hızını hesaplayın. Göç eden 10 nötrofili takip edin ve ortalama hızı hesaplayın.

Sonuçlar

Şekil 1. EC-MSC ko-kültürünün oluşturulması ve akış tabanlı bir yapışma testi kullanılarak nötrofil alımının analiz edilmesi. (A) Doku kültürü şişeleri üzerinde büyütülen (i) birincil EC ve (ii) pasaj 3 BMMSC'nin mikrografı. (B) 6 kuyulu Transwell filtre eklerinde kültürlenmiş EC ve MSC mikrografı. (C) Akış oluşturmak için kullanılan ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kollajenaz Tip Ia	Sigma	C2674	10 mg / ml'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 10 ml PBS'de seyreltin. -20 ° C'de 1 ml alikotlarda saklayın.
Dulbecco'nun PBS'si	Sigma	D8662	Kalsiyum ve magnezyum klorür ile. Steril tutun ve oda sıcaklığında saklayın.
1X Orta M199	Gibco (Gibco)	31150-022	Kullanmadan önce 37 °C su banyosunda ısıtın.
Gentamisin sülfat	Sigma	G1397	4°C'de saklayın. M199 500 ml'lik şişeye ekleyin.
İnsan epidermal büyüme faktörü	Sigma	E9644	-20 ° C'de 10μl alikotlarda saklayın.
Fetal baldır serumu (FCS)	Sigma	F9665 Serisi	İzole edilmiş EC'nin büyümesini ve yaşayabilirliğini sağlamak için FCS toplu olarak test edilmelidir. 56 ° C'de ısı etkisiz hale getirilir. -20 ° C'de 10 ml'lik alikotlarda saklayın.
Amfoterisin B	Gibco (Gibco)	15290-026	Güçlüdür ve bir hafta içinde toksik hale gelir, bu nedenle her hafta taze tam HUVEC ortamı hazırlanmalıdır. -20 ° C'de 1 ml'lik alikotlarda saklayın.
Hidrokortizon	Sigma	H0135	Stok etanol cinsindendir. -20 ° C'de 10μl alikotlarda saklayın.
Kollajenaz Tip II	Sigma	C6885	PBS'deki stoğu 100 mg / ml'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. -20 ° C'de 100μl alikotlarda saklayın.
Hyaluronidaz	Sigma	H3631	PBS'deki stoğu 20.000U / ml'lik nihai konsantrasyona seyreltin. -20 ° C'de 100μl alikotlarda saklayın.
50ml santrifüj tüp için 100μm hücre süzgeci	Bilimsel Laboratuvar Malzemeleri (SLS)	352360	Piyasada bulunan diğer hücre süzgeçleri (örneğin Greiner bio-one) da kullanılabilir.
DMEM düşük glikoz	Biyosera	LM-D1102/500	Kullanmadan önce 37 °C su banyosunda ısıtın.
Penisilin / Streptomisin karışımı	Sigma	P4333 Serisi	-20 ° C'de 1 ml'lik alikotlarda saklayın.
25cm2 doku kültürü şişesi	Sls	353109
75cm2 doku kültürü şişesi	Sls	353136
Kemik iliği mezenkimal kök hücreler flakon	Fransa	PT-2501	Varışta sıvı nitrojen içinde saklayın. Hücreler varışta 2. geçittedir, ancak 0 numaralı geçit olarak belirlenmiştir. Geçiş 3'e çıkarın ve daha sonra kullanmak üzere sıvı nitrojen içinde saklayın.
Mezenkimal kök hücre büyüme ortamı (MSCGM)	Fransa	PT-3001	Kullanmadan önce 37 °C su banyosunda ısıtın. Cell Tracker Green boyama için FCS'siz ortam kullanın.
EDTA (%0,02) çözümü	Sigma	E8008	4 ° C'de saklayın. Kullanmadan önce 37 ° C su banyosunda ısıtın.
Tripsin çözeltisi	Sigma	T4424	-20°C'de 2 ml'lik alikotlarda saklayın. Oda sıcaklığında çözdürün ve hemen kullanın.
Krivisyonel	Greiner biyo-bir	2019-02	Hücre süspansiyonu eklemeden önce eklemeden önce buz üzerinde tutun.
Bay Frosty Dondurma Kabı	Nalgene Belediyesi	5100-0001	Oda sıcaklığında saklayın. Hücreli kriyoviyaller eklerken, hücreleri sıvı nitrojene aktarmadan önce 24 saat boyunca -80 ° C'de saklayın.
Hücre izleyici yeşil boya	Yaşam teknolojileri	C2925	-20 ° C'de 5μl alikotlarda saklayın. 5 ml önceden ısıtılmış (37 ° C'de) MSCGM'de seyreltin.
Hücre sayma odaları	Nexcelom	SD-100	Alternatif olarak, bir hemositometre kullanılabilir.
Cellometer otomatik T4 hücre sayacı	Nexcelom	Otomatik T4-203-0238
Tümör nekroz faktör α (TNFa)	Ar-Ge Sistemleri	210-TA-100	PBS'deki stoğu 100.000U / ml'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. -80 ° C'de 10μl alikotlarda saklayın.
6 kuyulu, 0,4μm PET Transwell filtreleri	Sls	353090
10 ml'lik tüplerde K2-EDTA	Sarstedt		Oda sıcaklığında saklayın.
Histopaj 1119	Sigma	11191	4°C'de saklayın. Kullanmadan önce oda sıcaklığına ısıtın.
Histopaj 1077	Sigma	10771	4°C'de saklayın. Kullanmadan önce oda sıcaklığına ısıtın.
10ml yuvarlak tabanlı tüp	Appleton Ormanı	SC211 142 A.Ş.
%7,5 BSA Fraksiyon V çözeltisi	Yaşam teknolojileri	15260-037	4°C'de saklayın.
20ml Plastipak şırınga	BD şahin	300613
5ml Plastipak şırıngalar	BD şahin	302187
2ml Plastipak şırıngalar	BD şahin	300185
3M hipoalerjenik cerrahi bant 9m x 2.5cm	Mikro gözenek	1530-1	Şırınga musluğunu perspeks odasının duvarına sabitlemek için kullanın.
Silikon kauçuk boru, iç çap / dış çap (ID / OD) 1 / 3mm (ince boru)	Balıkçı Bilimsel	FB68854	Silikon boruyu uygun boyutta kesin. Doğrudan elektronik mikrovalfe giden tüm borular ince olmalıdır.
2/4 mm silikon kauçuk boru ID / OD (kalın boru)	Balıkçı Bilimsel	FB68855
Portex Blue Line Manometre hortumu	Smiths	200/495/200	Şırınga pompasına giden boru.
3 musluk	BOC Ohmeda AB
Pompa için cam 50ml şırınga	Popper Mikro Mat	550962	Kullanmadan önce hava kabarcıkları giderilerek astarlanmalıdır.
Cam lamel	Raymond Bir Kuzu		Sipariş üzerine yapılan 26x76mm lameller. Lot numarası 2440980.
Parafilm conta	Amerikan Ulusal Can Şirketi		Alüminyum bir şablon kullanarak 26x76 mm'lik bir parafilm parçası kesin ve bir neşter 10a kullanarak içine 20x4 mm'lik bir yuva kesin. Conta kalınlığı yaklaşık 133μm'dir.
İki perspeks paralel plaka	Wolfson Uygulamalı Teknoloji Laboratuvarı		8 vida ile bir arada tutulan paralel plakalardan oluşan özel olarak tasarlanmış hazne. Alt plaka, ortada kesilmiş bir görüntüleme yuvasına ve lamel için yer açmak üzere frezelenmiş sığ bir girintiye sahiptir. Üst perspeks plakası, akış kanalı üzerine yerleştirilmiş bir giriş ve çıkış deliğine sahiptir.
Minimum ölü alana sahip elektronik 3 mikro valf	Lee Ürünleri Ltd.	LFYA1226032H	Elektronik olarak 12 volt DC güç kaynağına bağlanır.
İnfüzyon / çekme için şırınga pompası (PHD2000)	Harvard Aygıtı	70-2001	Çapı 29 mm'ye ve yeniden doldurma (akış) hızına ayarlayın.
L şeklinde konektör	Labhut	LE876 Serisi	Giriş ve çıkış portlarına Ibidi microslide kanalına takmak için.
Video kamera	Qgörüntüleme	01-QIC-F-M-12-C	Digitall videoların kaydedilmesini sağlayan bir bilgisayara bağlı.
Görüntü-Pro Plus 7.0	Medya Sibernetik	41N70000-61592	Veri analizi için. Farklı davranışları görüntüleyen hücreleri manuel olarak etiketleyin. Yuvarlanma ve göç hızlarının analizi için hücreleri izleyin.

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Belediyesi Laboratuvarı