$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Kültürlenmiş kanser hücrelerinde kemoterapi ilaçları ile yaşlanma indüksiyonu
>NOT: Bu bölümdeki tüm hücre manipülasyon adımları, steril uygulamalar kullanılarak bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. Bu bölüm yapışık hücre tipleri için yazılmıştır. Süspansiyon hücreleri, belirtildiği gibi uygun modifikasyonlarla kullanılabilir.
- Kanser hücre hatlarını, tedarikçiden veya kullanılan spesifik hücre hatlarını sağlayan laboratuvardan alınan standart protokole göre büyütün.
not: Düşük geçişli hücreler (p < 10), tedavi edilmemiş hücre örneklerinde daha düşük replikatif yaşlanma seviyeleri, yani daha düşük arka plan olacağından genellikle tercih edilir.
- İlaçlarla yaşlanma indüksiyonundan bir gün önce, tripsin-EDTA% 0.25 (veya önerildiği gibi) ile hücreleri hasat edin. Eşit hacimde tam kültür ortamı ekleyerek tripsini nötralize edin ve hücre süspansiyonunu steril bir konik tüpe aktarın.
not: Süspansiyon hücreleri için bu adım gerekli değildir.
- Standart hemasitometre yöntemini kullanarak hücreleri sayın ve hücreleri/mL'yi kaydedin. Standart 6 kuyulu plastik kültür kaplarında 1 × 103-10 ×3 hücre/cm2'de plaka hücreleri.
not: Optimal kaplama yoğunluğu, hücrelerin çoğalma hızına bağlıdır ve kullanıcı tarafından belirlenmelidir. Hücreler, tedavi sırasında yaklaşık% 10 -% 20 birleşmede log faz büyümesinde olmalıdır (yani, kaplamadan sonra 18-24 saat inkübasyondan sonra). Süspansiyon hücrelerinin başlangıç yoğunluğu (hücreler/mL) kullanıcı tarafından belirlenmelidir. Altı oyuklu plakalar tipik olarak bir standart akış sitometrisi analiz numunesi için oyuk başına yeterli yaşlanan hücre verir. Akış sıralama yapılıyorsa, aşağı akış tahlilleri için yeterli sayıda yaşlanan hücrenin geri kazanılmasını sağlamak için çok daha büyük bir yüzey alanı (örneğin, çoklu P150 plakası) kullanılmalıdır (≥1 × 106).
- Kaplanmış hücreleri gece boyunca (18-24 saat)% 5 CO2 ve bir nem tavası ile 37 ° C'lik bir inkübatörde inkübe edin.
- Kaplanmış hücreleri yaşlanmaya neden olan kemoterapi ilaç(lar)ı ile tedavi edin. En az bir pozitif kontrol ekleyin, ör., etoposid (ETO) veya bleomisin (BLM). İlaç başına çift kuyucuklar hazırlayın. Yalnızca araçla kontrol edilen bir seti dahil edin.
not: Her deneysel ajan için bir doz eğrisi, kullanılan hücre hatlarında yaşlanma indüksiyonu için optimal konsantrasyonu belirlemek için kullanıcı tarafından test edilmelidir.
- Yaşlanmanın başlamasına izin vermek için% 5 CO2 ve bir nem tavası ile 37 ° C'lik bir inkübatörde hücreleri 4 gün boyunca inkübe edin. Işık mikroskobu kullanarak beklenen morfoloji değişikliklerini günlük olarak inceleyin.
not: Yaşlanma başlangıç oranına bağlı olarak 3-5 gün arası kuluçka süreleri kabul edilebilir. Kabul edilebilir bir yaşlanan hücre yüzdesi elde ederken sağlıklı büyüme koşullarını teşvik etmek için ortam değiştirilebilir ve ajan istenildiği gibi yeniden uygulanabilir (veya uygulanmayabilir).
- Yaşlanmanın başlamasından sonra, 37 ° C'de 5 dakika boyunca% 0.25 tripsin-EDTA ekleyerek hücreleri hasat edin. Hücreler süspansiyona ayrıldığında, tripsini eşit hacimde tam ortam ile nötralize edin.
not: Bu adım, süspansiyon halinde büyüyen hücreler için gerekli değildir. Yüzey işaretleyici boyama yapılacaksa, hücreler üzerindeki yüzey antijenlerini geçici olarak yok edebileceği için tripsin-EDTA kullanmaktan kaçının. Bunun yerine, steril bir plastik hücre sıyırıcı (veya yüzey antijenlerini korumak için tasarlanmış alternatif bir ayrışma reaktifi) kullanarak tek tabakayı nazikçe ayırın.
- Bir hematitometre kullanarak her numunedeki hücreleri sayın. Her numune için hücreleri/mL'yi hesaplayın.
not: Bu noktada ölü hücrelerin yüzdesini değerlendirmek için (yani ilaç tedavisi nedeniyle) tripan mavisi eklenebilir, ancak hücre ölümü de DDAOG boyama iş akışı sırasında bir floresan canlılık boyası ile belirlenecektir.
- Örnek başına ≥0.5 × 106 hücreyi 1.7 mL mikrosantrifüj tüplerine alikot.
not: Numune başına hücre sayısı tüm numunelerde standartlaştırılmalıdır.
- Tüpleri 4 ° C'de bir mikrosantrifüjde 1.000 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı çıkarın.
not: Soğutmalı bir mikrosantrifüj mevcut değilse, belirli esnek hücre tipleri için ortam sıcaklığında santrifüjleme yapmak kabul edilebilir olabilir.
- Bölüm 2'deki DDAOG boyamaya devam edin.
2. Hücre örneklerinde SA-β-Gal'in DDAOG boyaması
- 1 μM'lik bir nihai konsantrasyon için 1 mM Bafilomisin A1 stoğunu 1: 1.000x'te DMEM ortamına (FBS olmadan) seyreltin.
- 1 × 106 hücre/mL.
konsantrasyon için hücre pelet örneklerine (adım 1.11'den itibaren) hazırlanmış Baf-DMEM çözeltisini ekleyin
not: Örneğin, örnek başına 0,5 × 106 hücre kullanılıyorsa, 0,5 mL Baf-DMEM ekleyin.
- Yavaş bir hızda ayarlanmış bir döndürücü/çalkalayıcı üzerinde 37 ° C'de (CO2 olmadan) 30 dakika inkübe edin.
not: Boyama işlemi için çözeltileri asitleştirebilen ve böylece Baf ve DDAOG boyamasına müdahale edebilen CO2 inkübatörlerinden kaçının.
- Yıkamadan, her numuneye 1:500x'te (10 μg/mL final) DDAOG stok çözeltisini (5 mg / mL) ekleyin. Karıştırmak için pipetleyin. 37 °C'de (CO2 olmadan) 60 dakika boyunca bir döndürücü/çalkalayıcı üzerinde değiştirin. Direkt ışıktan koruyunuz.
- Tüpleri 4 ° C'de 1.000 x g'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın.
- Tüp başına 1 mL buz gibi %0,5 BSA ile yıkayın ve karıştırmak için pipetleyin. Tüpleri 4 ° C'de 1.000 x g'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Hücreleri iyice yıkamak için bu adımı 2 kez tekrarlayın. Süpernatanı çıkarın ve devam edin.
not: İstenmeyen floresan emisyonu (460/610 nm) sergileyebilen ayrılmamış DDAOG'u çıkarmak için adım 2.6'daki yıkama adımlarının gerçekleştirilmesi önemlidir.
- (İsteğe bağlı) DDAOG lekeli hücrelerin daha sonra analiz edilmek üzere sabitlenmesi ve saklanması
- Yıkanan her numuneye damla damla 0,5 mL buz gibi %4 paraformaldehit ekleyin. Karıştırmak için pipetleyin.
- Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
- Hücreleri 1 mL PBS ile 2x yıkayın.
- Akış sitometrisi analizinden önce numuneleri 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
not: Sabit numuneler için adım 2.8'i atlayın.
- Calcein Violet 450 stoğunu (1 mM) 1:1.000x'te %1 BSA-PBS'ye (1 μM final) seyreltin. Adım 2.6'dan yıkanmış hücre peletlerine 300 μL (kültürlenmiş hücre örnekleri için) ekleyin. Karanlıkta buz üzerinde 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Akış sitometrisi kurulumuna geçin (bölüm 3).
3. Akış sitometresi kurulumu ve veri toplama
- Hücre örneklerini akış sitometrisi cihazı ile uyumlu tüplere aktarın. Tüpleri buzun üzerine yerleştirin ve ışıktan koruyun.
not: Hücre süspansiyonlarında agregalar gözlenirse, analizden önce süspansiyonu 70-100 μm hücre süzgeçlerinden geçirin. 40 μm'lik süzgeçler kullanmayın çünkü bunlar daha büyük yaşlanan hücrelerin bir kısmını dışlayabilir.
- Başvurulan yazılımda (Malzeme Tablosuna bakın), aşağıdaki grafikleri açın: 1) FSC-A ve SSC-A nokta grafiği, 2) mor kanal histogramı, 3) uzak kırmızı kanal (örneğin, APC-A) ve yeşil kanal (örneğin, FITC-A) nokta grafiği.
not: Çift dışlama grafikleri ve tek kanallı histogramlar da kullanılabilir, ancak kesinlikle gerekli değildir.
- Sitometre veri toplamayı başlatın.
- Yalnızca araca özel kontrol örneğini yerleştirinampDDAOG ile boyanmış giriş portuna. Düşük bir alım hızında, örnek verileri almaya başlayın.
- FSC ve SSC voltajlarını, olayların %>90'ı çizim içinde yer alacak şekilde ayarlayın. Hücreler çizime tam olarak uymuyorsa, alan ölçeklendirme ayarını 0,33-0,5 birime düşürün.
- Verileri kaydetmeden yalnızca araç numunesini çıkarın.
- (İsteğe bağlı) 1 mL PBS içeren bir sitometre tüpüne bir damla gökkuşağı kalibrasyon mikro kürecikleri ekleyin. Tüpü sitometre giriş portuna yerleştirin. Örnek verileri almaya başlayın.
- Mor, yeşil ve uzak kırmızı kanal voltajlarını, gökkuşağı mikroküresinin en üst tepe noktası her kanalda 104-105 birim bağıl floresan aralığında olacak ve tüm tepe noktaları her kanalda iyi bir şekilde ayrılacak şekilde ayarlayın. 10.000 olay kaydedin. Tüpü çıkarın.
- Pozitif kontrol örneğini (örn., BLM, ETO) DDAOG ile boyanmış giriş portuna. Düşük bir hızda, örnek veriler elde edin. Olayların %90'ından fazlasının tüm grafiklerde yer aldığından emin olmak için FSC, SSC, mor, yeşil ve uzak kırmızı kanallardaki olayları gözlemleyin. Yalnızca araç kontrolüne kıyasla AF ve DDAOG sinyalinde bir artış arayın.
- Bir sıralama sitometresi kullanıyorsanız, bu adımda sıralamayı başlatın.
- Kayıt tutma amacıyla, kontrol örneği ve sıralanan her örnek için 10.000 hücre kaydedin.
- İstenilen miktarda hücreyi (≥1 × 10:6 tipik olarak uygundur) 3-5 mL kültür ortamı ile alete uygun bir toplama tüpüne sıralayın.
- Sıralamadan sonra, aşağı akış kültürüne veya analizine geçin.
not: Burada kullanılan kalibre edilmiş akış sitometresi için, optimum kanal voltajları tipik olarak 250 ile 600 (orta aralık) arasındadır, ancak optimum voltajlar ve kanal voltajı aralıkları cihazlar arasında değişecektir. Voltage kullanmaktan kaçının, bu da sinyali bastırabilir veya gürültüyü yükseltebilir.
- 3.1-3.5 adımlarını tamamladıktan ve sitometre ayarlarında gerektiği gibi ayarlamalar yaptıktan sonra, tüm numuneler için verileri kaydedin. Ayarların tüm örnek kayıtlar için aynı kaldığından emin olun. Kültürlenmiş hücre örneği başına ≥10.000 olay kaydedin.
not: Geçit oluşturma ve analiz, veri toplama yazılımı (örneğin, FACSDiva) kullanılarak gerçekleştirilebilse de, satın alma sonrası ayrı bir analiz yazılımı (FlowJo) kullanılarak yürütülecek eksiksiz bir geçit ve analiz iş akışı aşağıdaki bölüm 4'te açıklanmıştır. Sitometre iş istasyonunda geçirilen süreyi azaltmak ve özel analiz yazılımında bulunan ek araçlardan yararlanmak için satın alma sonrası analiz tercih edilir.
- Örnek verileri .fcs dosya biçiminde kaydedin. Dosyaları akış sitometrisi analiz yazılımı (ör. FlowJo) ile donatılmış bir iş istasyonu bilgisayarına aktarın.
4. Akış sitometrisi veri analizi
NOT: Sunulan iş akışı FlowJo yazılımını kullanır. Bu bölümde açıklanan temel adımlar benzer şekilde izlenirse, alternatif akış sitometrisi veri analizi yazılımı kullanılabilir.
- FlowJo yazılımını kullanarak, adım 3.7'deki .fcs veri dosyalarını açın.
- Düzen penceresini açın.
- Tüm örnekleri mizanpaj penceresine sürükleyip bırakın.
- Canlı hücreleri kapılayın.
- İlk olarak, veri penceresini açmak için yalnızca araç kontrolünün örnek verilerine çift tıklayın.
- Verileri mor kanal histogramı olarak görselleştirin. CV450 ile boyanan canlı hücreleri, ölü hücrelerden daha parlak floresanslarına dayanarak tanımlayın.
- Yalnızca uygun hücreleri dahil etmek için tek kapılı histogram aracını kullanarak bir geçit çizin. Kapıyı uygun olarak adlandırın.
- Ardından, örnek düzeni penceresinden, geçidi eşit şekilde uygulamak için uygun geçidi diğer hücre örneklerinin üzerine sürükleyin.
- Düzen penceresinde, tüm örnekleri mor kanal (canlılık) histogramları olarak görselleştirin. Devam etmeden önce numuneler arasında canlı hücre kapısının uygun olduğunu doğrulayın; Değilse, gerektiği gibi ayarlamalar yapın.
not: Canlılık boyama, tedaviler arasında farklılıklar gösterebilir.
- Yaşlanan hücreleri geç.
- Veri penceresini açmak için yalnızca araç kontrolü için kapılı canlı hücre verilerine çift tıklayın.
- Verileri, uzak kırmızı kanal (DDAOG) ve yeşil kanal (AF) için bir nokta grafiği olarak görselleştirin.
- DDAOG+ ve AF+ (sağ üst kadran) olan hücrelerin %<5'ini içerecek şekilde dikdörtgen geçit aracını kullanarak bir geçit çizin. Kapıyı yaşlanan olarak adlandırın.
- Ardından, örnek düzeni penceresinden, geçidi eşit şekilde uygulamak için yaşlanan geçidi diğer hücre örneklerinin uygun alt kümelerine sürükleyin.
- Düzen penceresine, bölüm 4.4'te yer alan tüm uygun hücre alt kümelerini sürükleyip bırakın. Tüm uygulanabilir örnekleri uzak kırmızı (örneğin, APC-A) ve yeşil kanal (örneğin, FITC-A) nokta grafikleri olarak görselleştirin.
- Adım 4.5.3'te çizilen yaşlanma kapısının tüm grafiklerde görünür olduğundan ve yalnızca araç kontrolü kapısının %≤5-%10 yaşlanan hücreler sergilediğinden emin olun.
- Yukarıdaki adımlar kullanılarak yaşlanan hücrelerin yüzdesi belirlendikten sonra, elde edilen verileri FlowJo grafiklerini kullanarak, bir veri tablosunda özetlenerek ve/veya standart yazılım kullanılarak istatistiksel olarak analiz edilerek sunun.