$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Reaktiflerin Hazırlanması
- Safra tuzları ortamı: % 0.4 safra tuzu (ağırlık / hacim) içeren triptik soya suyu (TSB) hazırlamak için, 50 mL otoklavlanmış TSB'de 200 mg safra tuzunu yeniden süspanse edin. Filtre, 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize eder. Haftalık taze orta yapın.
Notlar: Rutin olarak kullanılan safra tuzları, küçükbaş ve sığır safra keselerinden izole edilen 1:1 oranında sodyum kolat ve sodyum deoksikolat karışımıdır. Daha önce gösterildiği gibi, safra tuzunun neden olduğu biyofilm oluşumu için glikozun varlığı gerekliydi. TSB, Luria-Bertani (LB) suyuna göre glikoz ekledi; ve bu nedenle, Shigella'da ve analiz edilen diğer enterik patojenlerde biyofilm oluşumunu indüklemek için yeterliydi. Analiz edilecek bakterilere bağlı olarak, farklı glikoz konsantrasyonları veya farklı şeker gereksinimleri gerekebilir.
- Suda% 0,5 w / v kristal viyole: 2,5 g kristal viyoleyi 500 mL damıtılmış suda çözün. Filtre, 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edilir.
2. Bakterilerin Hazırlanması
- Steril bir kültür tüpünde 3 mL TSB'yi tek, iyi izole edilmiş bir koloni ile aşılayarak test edilecek bakteri suşlarının gece boyunca kültürlerini büyütün. Gece boyunca inkübasyon (16 - 24 saat) için 225 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de inkübe edin.
not: Suşlar her 2 ila 4 haftada bir dondurucu stoklarından alınmalı ve en fazla 2 haftalık plakalarda muhafaza edilmelidir.
3. Katı Faz Yapışma Testi
NOT: Bu test, 96 oyuklu bir plaka yöntemi kullanarak yapışık bakterileri ölçer. Bakteriler düz tabanlı plakalarda statik olarak büyütülür. Yapışmayan bakterileri uzaklaştırmak için yıkama yapılır ve yapışan bakteriler kristal viyole ile boyanır. Kristal viyole lekesi, bakteri hücre duvarındaki peptidoglikanı bağlar ve etanol kullanılarak çözülebilir. Yapışan bakteri sayısı, kristal viyole tutulumuna göre belirlenir.
- İki adet 1,5 mL tüp ayarlayın. TSB veya TSB + safra tuzları (BS) ile etiketleyin.
- İlgili tüplere 1 mL TSB veya TSB + BS ekleyin.
- Tüpleri 20 μL gece boyunca kültürle (1:50 seyreltmede) aşılayın.
- Steril, berrak, düz tabanlı, doku kültürü ile muamele edilmiş 96 oyuklu bir plakada, boş kontrol görevi görmesi için üç oyuğa 130 μL/kuyu aşılanmamış kontrol ortamı ekleyin. Test edilecek her ortam türü (TSB ve TSB + BS) için üç kontrol kuyusu kurun.
- Üç oyuğa 130 μL / kuyucuk aşılanmış kültür ekleyin ve tüm deney koşulları üç nükte halinde kaplanana kadar tekrarlayın.
- Statik olarak 37 °C'de 4 - 24 saat inkübe edin.
- Bir plaka okuyucu kullanarak OD600'ü kaydedin. Kontrol kuyularını 'boş' olarak ayarlayın. Kontrol ortamının bulanıklık kanıtı olmadan temiz olduğunu onaylayın. Herhangi bir bulanıklık tespit edilirse, deneyi atın. OD600 değerleri, bakteri suşları arasında büyüme hızında önemli farklılıklar varsa verileri normalleştirmek için kullanılabilir.
- Plakayı hafifçe eğerek ve ortamı kuyunun alt kenarında yavaşça aspire ederek bir vakum hattı kullanarak kültür ortamını çıkarın. Plastik yüzeyde bulunan yapışkan bakteri popülasyonunu bozmadan tüm kültür ortamını topladığınızdan emin olun. İnkübasyon süresi boyunca hücre dışı polisakkarit (EPS) matrisi üretildiyse, matris beyaz bir çökelti olarak görselleştirilecektir. EPS matrisini bozmayın.
- Kuyucukları bir kez 200 μL steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile nazikçe yıkayın. Vakum hattını kullanarak PBS yıkamasını çıkarın.
- Kuruması için plakayı ters çevirin. En az 20 dakika kurumasını bekleyin.
not: Biyofilmin boyamadan önce iyice kurutulması gerektiğinden, protokol bu adımda birkaç saat veya hatta gece boyunca duraklatılabilir. Eklenen kurutma süresi, boyama prosedürünü değiştirmeyecek, eksik kurutma ise sonuçların nicelliğini ve tekrarlanabilirliği etkileyecektir.
- Her deney ve kontrol kuyusuna 150 μL% 0.5 kristal viyole ekleyin.
- Oda sıcaklığında (RT) 5 dakika inkübe edin.
- Kuyuları bir kez 400 μL damıtılmış su ile yıkayın. Eklenen hacim, kuyucukların kenarlarından kalan kristal viyole lekesinin çıkarılmasına yardımcı olur. Yıkamayı vakum hattı ile çıkarın.
- Kuyuları 200 μL damıtılmış su ile beş kez yıkayın. Yıkamayı vakum hattıyla çıkarın.
not: Kantifikasyon için kapsamlı yıkama önemlidir. Boş kuyular damıtılmış sudan temizlendiğinde ve herhangi bir kalıntı kristal viyole lekesi içermediğinde, bir sonraki adıma geçin.
- Plakayı kuruması için ters çevirin, ışıktan koruyun. Yukarıda belirtildiği gibi plakanın tamamen kuruduğundan emin olun.
- Kuyuları 200 μL% 95 etanol ile lekeleyin. Plakayı çalkalayıcı üzerinde 30 dakika inkübe edin. Özellikle yüksek sıcaklıklarda buharlaşmayı önlemek için bu adımı 4 °C'de gerçekleştirin.
- Bir plaka okuyucu kullanarak optik yoğunluğu 540'ta (OD540) kaydedin.
not: Kristal viyolenin maksimum emilimi için dalga boyu 590 nm'ye yakındır. Literatür, kristal viyole absorbansı için OD540 - OD595 arasında bir aralık bildirmektedir; bu nedenle, plaka okuyucuya dayalı olarak mevcut bir dalga boyu seçin.