1. Reaktiflerin Hazırlanması
- Safra tuzları (BS) ortamı: % 0.4 safra tuzları (ağırlık / hacim) içeren triptik soya suyu (TSB) hazırlamak için, 50 mL otoklavlanmış TSB'de 200 mg safra tuzunu yeniden süspanse edin. Filtre, 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edilir. Haftalık taze orta yapın.
Notlar: Rutin olarak kullanılan safra tuzları, küçükbaş ve sığır safra keselerinden izole edilen 1:1 oranında sodyum kolat ve sodyum deoksikolat karışımıdır. Daha önce gösterildiği gibi, safra tuzunun neden olduğu biyofilm oluşumu için glikozun varlığı gerekliydi. TSB, Luria-Bertani (LB) suyuna göre glikoz ekledi; ve bu nedenle, Shigella'da ve analiz edilen diğer enterik patojenlerde biyofilm oluşumunu indüklemek için yeterliydi. Analiz edilecek bakterilere bağlı olarak, farklı glikoz konsantrasyonları veya farklı şeker gereksinimleri gerekebilir.
- Suda% 0,5 w / v kristal viyole: 2,5 g kristal viyoleyi 500 mL damıtılmış suda çözün. Filtre, 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edilir.
- Floresein izotiyosiyanat (FITC) ile konjuge edilmiş Concanavalin A (ConA): Stoku 1x PBS'de yeniden oluşturun. 10 mg konsantre stoğu 400 μL 1x PBS ile 25 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin ve ışıktan koruyun.
- PBS + Glikoz: 0.2 g glikozu 10 mL 1x PBS'de çözün (% 2 w / v glikoz finali). Filtre, 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edilir. Kullanım gününde taze yapın.
- PBS + Safra Tuzları: 40 mg'ı 10 mL 1x PBS'de çözün (safra tuzları finali% 0.4). Filtre, 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edilir. Kullanım gününde taze yapın.
- PBS + glikoz ve safra tuzları: 40 mg safra tuzunu ve 0.2 g glikozu 10 mL 1x PBS'de çözün (% 0.4 w / v safra tuzları ve% 2 w / v glikoz finali). Filtre, 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edilir. Kullanım gününde taze yapın.
- LB agar plakalarını hazırlayın.
- Formaldehit/glutaraldehit düzeltmesi: 14 mL 1x PBS'ye 810 μL formaldehit (%37 stok çözeltisi, %3 nihai konsantrasyon) ve 125 μL glutaraldehit (%25 stok çözeltisi, %0.25 nihai konsantrasyon) ekleyin. İyice karıştırın ve 4 °C'de saklayın. Doğru kullanım için düzeltme soğuk olmalıdır.
Dikkat: Düzeltme toksiktir ve tehlikeli atık bertarafı gerektirir.
- Antifade mountant solüsyonu: Bakterilerin DNA'sını floresan olarak boyarken immünofloresan mikroskopi numunelerinin foto-ağartmasını engellemek için 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) boyası içeren antifade mountant solüsyonu kullanın.
2. Bakterilerin Hazırlanması
- Steril bir kültür tüpünde 3 mL TSB'yi tek, iyi izole edilmiş bir koloni ile aşılayarak test edilecek bakteri suşlarının gece boyunca kültürlerini büyütün. Gece boyunca inkübasyon (16 - 24 saat) için 225 rpm'de çalkalanarak 37 °C'de inkübe edin.
not: Suşlar her 2 ila 4 haftada bir dondurucu stoklarından alınmalı ve 2 haftadan eski olmayan plakalarda muhafaza edilmelidir.
3. EPS Matris Algılama
NOT: Bu ücretsiz tahliller, EPS'yi ölçer ve görselleştirir. Her ikisinde de EPS, polisakkaritleri bağlamak için bir lektin kullanılarak tespit edilir. Floresan konjuge protein, miktar tayinine izin verir.
- EPS'nin yarı kantitatif tespiti
- İki adet 1,5 mL tüp ayarlayın. TSB veya TSB + BS ile etiketleyin.
- İlgili tüplere 1 mL TSB veya TSB + BS ekleyin.
- Tüpleri 20 μL gece boyunca kültür (1:50 seyreltme) ile aşılayın.
- Steril, siyah, düz tabanlı, doku kültürü ile muamele edilmiş 96 oyuklu bir plakada, boş kontrol görevi görmesi için üç oyuğa 130 μL/kuyu aşılanmamış kontrol ortamı ekleyin. Test edilecek her ortam türü için üç kontrol kuyusu kurun. Kuyucuklara 130 μL / kuyucuk aşılanmış kültür ekleyin ve tüm deney koşulları üç kopya halinde kaplanana kadar tekrarlayın.
- Statik olarak 37 °C'de 4 - 24 saat inkübe edin.
- Kültür ortamını bir pipetle, ideal olarak çok kanallı bir pipetle 96 oyuklu şeffaf bir plakaya aktarın. Yapışan popülasyonu ve/veya plastik yüzeyde bulunan EPS'yi bozmadan tüm kültür ortamını toplamaya dikkat edin. Kenara.
- 1x PBS'de 200 μL/kuyucuk formaldehit/glutaraldehit kullanarak siyah plakayı RT'de 15 dakika sabitleyin.
- Yapışık popülasyon sabitlenirken, adım 1.1.6'daki süpernatan fraksiyonu değerlendirin. Bir plaka okuyucu kullanarak OD600'ü kaydedin. Kontrol kuyularını 'boş' olarak ayarlayın. Kontrol ortamının bulanıklık kanıtı olmadan temiz olduğunu onaylayın. Herhangi bir bulanıklık tespit edilirse, deneyi atın.
- Alternatif olarak, tüm test siyah şeffaf bir alt plakada gerçekleştirilebilir. Bu durumlarda, OD600 değerleri kaydedilebilir ve kültür ortamı daha sonra adım 3.1.7'ye geçmeden önce atılabilir. OD600 değerleri, bakteri suşları arasında büyüme hızında önemli farklılıklar olması durumunda verileri normalleştirmek için kullanılabilir.
- Sabitlemeyi çıkarın ve tehlikeli atıklara atın.
- Kuyucukları 200 μL/kuyu steril PBS ile iki kez nazikçe yıkayın. Plakayı hafifçe eğerek ve yıkamayı kuyunun alt kenarından yavaşça aspire ederek vakum hattını kullanarak PBS yıkamasını çıkarın.
- 150 μL / kuyucuk 25 μg / mL ConA-FITC ekleyin ve RT'de 15 dakika inkübe edin.
- 200 μL PBS ile iki kez nazikçe yıkayın.
- Her kuyucuğa 150 μL PBS ekleyin. Floresanı 488 nm'de kaydedin.
