1. Reaktiflerin Hazırlanması
- Safra tuzları ortamı: % 0.4 safra tuzu (ağırlık / hacim) içeren triptik soya suyu (TSB) hazırlamak için, 50 mL otoklavlanmış TSB'de 200 mg safra tuzunu yeniden süspanse edin. Filtre, 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edilir. Haftalık taze orta yapın.
Notlar: Rutin olarak kullanılan safra tuzları, küçükbaş ve sığır safra keselerinden izole edilen 1:1 oranında sodyum kolat ve sodyum deoksikolat karışımıdır. Daha önce gösterildiği gibi, safra tuzunun neden olduğu biyofilm oluşumu için glikozun varlığı gerekliydi. TSB, Luria-Bertani (LB) suyuna göre glikoz ekledi; ve bu nedenle, Shigella'da ve analiz edilen diğer enterik patojenlerde biyofilm oluşumunu indüklemek için yeterliydi. Analiz edilecek bakterilere bağlı olarak, farklı glikoz konsantrasyonları veya farklı şeker gereksinimleri gerekebilir.
- Suda% 0,5 w / v kristal viyole: 2,5 g kristal viyoleyi 500 mL damıtılmış suda çözün. Filtre, 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize eder.
- Fosfat tamponlu salin (PBS) + Glikoz: 0.2 g glikozu 10 mL 1x PBS'de çözün (%2 w/v glikoz finali). Filtre, 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize eder. Kullanım gününde taze yapın.
- PBS + Safra Tuzları: 40 mg'ı 10 mL 1x PBS'de çözün (safra tuzları finali% 0.4). Filtre, 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edilir. Kullanım gününde taze yapın.
- PBS + glikoz ve safra tuzları: 40 mg safra tuzunu ve 0.2 g glikozu 10 mL 1x PBS'de çözün (% 0.4 w / v safra tuzları ve% 2 w / v glikoz finali). Filtre, 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize eder. Kullanım gününde taze yapın.
- LB agar plakalarını hazırlayın.
2. Bakterilerin Hazırlanması
- Steril bir kültür tüpünde 3 mL TSB'yi tek, iyi izole edilmiş bir koloni ile aşılayarak test edilecek bakteri suşlarının gece boyunca kültürlerini büyütün. Gece boyunca inkübasyon (16 - 24 saat) için 225 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de inkübe edin.
not: Suşlar, her 2 ila 4 haftada bir dondurucu stoklarından yeniden çizilmeli ve en fazla 2 haftalık plakalarda tutulmalıdır.
3. Dağılım Testi
NOT: Bu tahlilde, biyofilmin bakteri dispersiyonu yoluyla parçalanması tespit edilir. Burada olgun biyofilmler oluşturulur ve daha sonra (genellikle ertesi gün) besiyeri PBS veya takviye edilmiş PBS ile değiştirilir. Süpernatan bileşen daha sonra biyofilmden ayrılan bakteri sayısını ölçmek için değerlendirilir.
- İki adet 1,5 mL tüp ayarlayın. TSB veya TSB + BS (safra tuzları) ile etiketleyin.
- İlgili tüplere 1 mL TSB veya TSB + BS ekleyin.
- Tüpleri 20 μL gece boyunca kültürle (1:50 seyreltmede) aşılayın.
- Steril, berrak, düz tabanlı, doku kültürü ile muamele edilmiş 96 oyuklu bir plakada, boş kontrol görevi görmesi için üç oyuğa 130 μL/kuyu aşılanmamış kontrol ortamı ekleyin. Test edilecek her ortam türü için üç kontrol kuyusu kurun.
- Üç oyuğa 130 μL / oyuklu aşılanmış kültür ekleyin ve tüm deney koşulları üç nüsha halinde kaplanana kadar tekrarlayın.
- Plakayı statik olarak 37 ° C'de 4 - 24 saat inkübe edin.
- Devam etmeden önce PBS, PBS + glikoz, PBS + safra tuzları ve PBS + safra tuzları + glikozu 37 °C'ye ısıtın. Bu reaktifleri günlük olarak taze olarak hazırlayın.
- Bir plaka okuyucu kullanarak optik yoğunluğu, OD600'ü kaydedin. Kontrol kuyularını 'boş' olarak ayarlayın. Bulanıklık kanıtı olmadan ortamın berrak olduğunu onaylayın. Herhangi bir bulanıklık tespit edilirse, deneyi atın. OD600 değerleri, bakteri suşları arasında büyüme hızında önemli farklılıklar varsa verileri normalleştirmek için kullanılabilir.
- Bir vakum hattı kullanarak kültür ortamını çıkarın. Plastik yüzeyde bulunan yapışkan popülasyonu bozmadan tüm kültür ortamını topladığınızdan emin olun.
- Kuyucukları 200 μL/kuyu steril PBS ile iki kez nazikçe yıkayın. Vakum hattını kullanarak PBS yıkamasını çıkarın.
- Yıkamayı aşağıdakilerden 130 μL / kuyu ile her biri üç oyukta değiştirin: PBS, PBS + glikoz, PBS + safra tuzları ve PBS + safra tuzları + glikoz. Bu reaktifler 37 °C'ye önceden ısıtılmalıdır.
- Plakayı 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
- Plakayı 37 °C inkübatörden dikkatlice çıkarın. Süpernatanları taze, steril 96 oyuklu bir plakaya aktarın.
- 96 oyuklu bir plaka veya seyreltme bloğu kullanarak, süpernatantın steril PBS'ye 10 kat (1:10) seri seyreltmesini hazırlayın.
not: Seyreltme serisi, test edilecek bakteri suşuna bağlı olarak seyreltilmemiş ila 10-6 arasında değişmelidir. Optimum seyreltme aralığını belirlemek için pilot deneyler yapılabilir.
- Her seyreltmeden 5 μL'lik plakayı çok kanallı bir pipet kullanarak LB agar üzerine koyun. Gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Ertesi gün kolonileri sayın ve geri kazanım kolonisi oluşturan birimleri (CFU) belirlerken seyreltme faktörünü hesaba katın. 1x PBS kontrolüne (%100 olarak ayarlanmış) göre yüzde dağılımı hesaplamak için, her bir tedavi koşulundan geri kazanım CFU'sunu 1x PBS kontrol örneğinden geri kazanım CFU'suna bölün.
not: İlgilenilen bakteri türü için rutin ortam plakaları da kullanılabilir. Örneğin, Shigella Kongo kırmızı plakaları üzerine kaplanabilir. Uygun nokta kaplama teknikleri için plakaların kuru olduğundan emin olun.
