$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Mantar Kolonisi Üzerinde İn Vitro Bakteri Biyofilminin Hazırlanması
- Bakteri kültürünü 3 dakika boyunca 5.000 x g'da santrifüjleyin ve peleti 25 ml steril 0.1 M potasyum fosfat tamponunda (25 g / L KH2PO4 ve 2.78 g / L K2HPO4, pH 5.8) süspanse edin. Bu adımı bir kez tekrarlayın ve son bakteri konsantrasyonunu aynı tamponla 109 hücre / ml'ye ayarlayın.
- 6 oyuklu bir mikroplakayı 5 ml bakteri süspansiyonu (veya negatif kontrol için steril 0.1 M potasyum fosfat tamponu) ile doldurun.
- Her zar üzerinde tek bir mantar kolonisi bulunan selofan kareleri elde etmek için mantar kültürünün selofan zarını steril bir tıraş bıçağıyla kesin. Hif içeren selofan karelerini forseps kullanarak katı ortamdan dikkatlice çıkarın ve hif içeren selofan karesini bakteri süspansiyonu içeren mikroplakanın bir kuyusuna aktarın.
- Mantar kolonileri hala selofana bağlıyken mikroplakayı hafifçe sallayın; Ardından, mantar kolonilerini plakada bırakarak selofan tabakalarını çıkarın.
- Mikroplakayı, incelenen mikroorganizmalara uyarlanmış bir sıcaklıkta hafif çalkalama (~ 60 rpm) ile inkübe edin.
not: Kuluçka süresi, biyofilmin kurulma hızına ve analiz edilecek aşamaya bağlıdır. P. fluorescens BBc6/L. bicolor için, erken evre biyofilmler elde etmek için 20 ° C'de 30 dakika ve olgun biyofilmler elde etmek için 16 saate kadar inkübe edin.
2. Lazer Taramalı Konfokal Mikroskopi Biyofilm Oluşumunun Analizi
- Numune hazırlama
- Planktonik bakterileri ve hiflere elektrostatik olarak bağlı bakterileri uzaklaştırmak için, mantarı 5 ml güçlü bir tuz çözeltisi (NaCl, 17 g / L) ile doldurulmuş 6 oyuklu yeni bir mikroplakaya aktararak durulayın; 1 dakika boyunca hafifçe çalkalayın.
- Mantarı 5 ml steril 0.1 M potasyum fosfat tamponu içeren 6 oyuklu yeni bir mikroplakaya aktarın, 2 dakika hafifçe çalkalayın ve mantarı taze potasyum fosfat tamponuna aktarın.
- Mantar kolonisinin görüntülenecek kısmını bir neşter ile kesin, böylece elde edilen bölüm mantar kolonisinin yaklaşık yarısını içerecek şekilde potasyum fosfat tamponunda tutun.
- Numuneyi lekelemek için, uygun bir floresan boya (analizin amacına bağlı olarak) içeren steril suyla doldurulmuş bir Petri kabına aktarın ve karanlıkta inkübe edin.
- Mantar ağını görselleştirmek için, örneğin, Kongo Kırmızısı (% 0.1 nihai konsantrasyon, 5 dakikalık inkübasyon), Alexa Fluor 633 (10 μg / ml nihai konsantrasyon, 10 dakikalık inkübasyon) veya FUN1 (10 μM nihai konsantrasyon, 10 dakikalık inkübasyon) ile konjuge buğday tohumu aglütinini (WGA) kullanın.
- Floresan etiketli olmayan bir bakteri kullanılıyorsa, bakteri hücrelerini, ticari olarak temin edilebilen çok sayıda hücre bazlı DNA boyası arasından DNA'ya özgü bir floresan probu ile boyayın. Örneğin, DAPI kullanın (0.25 μg / ml nihai konsantrasyon, 10 dakikalık inkübasyon).
- Matris proteinlerini görselleştirmek için bir protein boyası kullanın.
- Boyamadan sonra, numuneyi 10 ml steril 0.1 M potasyum fosfat içeren bir Petri kabı kapağına aktararak durulayın ve 1 dakika hafifçe çalkalayın.
- Petri kabı kapağına bir sürgüyü yarıya batırın ve kesilen bölümü nazikçe sürgünün üzerinde yüzecek şekilde getirin. Ardından, slaytı tampon çözeltisinden yavaşça çıkarın ve numunenin slayta nazikçe yerleşmesine izin verin.
not: Bu adımda, biyofilm rahatsızlığını önlemek için nazikçe ilerlemek çok önemlidir.
- Son olarak, numuneye 10 μl solma önleyici montaj ortamı ekleyin ve üzerini bir cam lamel ile kapatın.
not: Slayt hazırlandıktan sonra, biyofilm yapısında değişiklik olmasını önlemek için mikroskobik analiz mümkün olan en kısa sürede (en fazla 30 dakika içinde) yapılmalıdır.