Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Farklı Tümör Bölgelerinde Yerleşik T Hücresi Migrasyonunun Gerçek Zamanlı Analizi

Özet

Kaynak: Peranzoni, Elisa, et al. Ex vivo Görüntüleme İnsan Akciğer Tümör Dilimlerinde Yerleşik CD8 T Lenfositlerinin Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu videoda, insan akciğer tümörü dilimleri içinde floresan olarak bağlanmış antikorlarla işaretlenmiş yerleşik tümöre sızan CD8 T hücrelerinin görüntülenmesi açıklanmaktadır. Bu teknik, konfokal mikroskopi kullanılarak CD8 T hücre göçünün gerçek zamanlı analizlerine izin verir.

Protokol

1. Yerleşik CD8 T hücrelerinin ve tümör hücrelerinin immün boyaması

1. Antikorları (son konsantrasyon 10 μg/mL) ve nükleer boyayı (son konsantrasyon 1 μg/mL) fenol kırmızısı içermeyen RPMI-1640 ortamında seyreltin.
   not: CD8 T lenfositlerini ve tümör epitel hücrelerini etiketlemek için sırasıyla floresan bağlantılı anti-CD8 (murin IgG, klon SK1) ve anti-EpCAM (epitel hücre adezyon molekülü) (murin IgG HEA-125) antikorları kullanın. Fibroblastları ve aktive edilmiş endotel hücrelerini etiketlemek için floresan bağlantılı anti-CD90 / Thy1 (murin IgG, klon 5E10) antikoru kullanın. Doku canlılığını değerlendirmek için hücrelerin çekirdeğini tehlikeye atılmış bir plazma zarı ile etiketlemek için 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) kullanın.
2. Kültür plakalarını inkübatörden çıkarın ve paslanmaz çelik rondelaların içindeki sıvıyı aspire etmek için bir pipet kullanın. Hücre kültürü eklerinin altına yerleştirilen 1.1 mL RPMI-1640 ortamını çıkarmayın.
3. Dilime dokunmadan ve bir pipet ucu kullanarak, her bir tümör dilimine antikorları içeren çözeltiden 40 μL ekleyin.
4. Antikor lekelenmesine izin vermek için plakayı 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
5. İnce forsepslerle rondelaları çıkarın, dilimleri çıkarın ve fenol kırmızısı içermeyen RPMI-1640 ortamına 10 saniye batırın. Dilimleri hücre kültürü eklerine geri yerleştirin ve her bir dilimin üzerine bir damla fenol kırmızısı içermeyen RPMI-1640 ortamı ekleyin. Plakayı 37 °C'de 10 dakika tutun. Görüntülemeye devam edin.

2. İnsan akciğer tümörü dilimleri içinde yerleşik CD8 T hücresi göçünün görüntülenmesi ve analizi

NOT: Bu protokolde kullanılan konfokal mikroskop, 25x suya daldırma objektifi (25x/0.95 NA) ile donatılmış dik bir eğirme diskidir.

1. Mikroskop kurulumunun hazırlanması
   1. Görüntüleme seansına başlamadan birkaç saat önce mikroskop ısı odasının sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın.
   2. Tümör dilimlerini oksijenli (%5 CO₂,% 95 O₂) fenol kırmızı içermeyen RPMI ortamı ile sürekli olarak perfüze etmek için bir sistem kurun (Şekil 1). Perfüzyon ortamını görüntüleme odasına akıtmak için peristaltik bir pompa kullanın ve çözeltiyi bir atık toplama şişesine aspire edin.
   3. Oksijenli çözeltinin perfüzyon tüplerinden geçmesine izin vermek için peristaltik pompayı çalıştırın.
2. İnce forsepslerle, dilimi 6 oyuklu plakadan çıkarın ve fenol kırmızısı içermeyen RPMI ortamı ile doldurulmuş 35 mm'lik plastik tabağa aktarın. Dilimi, 2 mm aralıklı dişlere sahip 19,7 mm çapında bir dilim ankrajı ile hareketsiz hale getirin. Petri kabını mikroskobun görüntüleme aşamasına yerleştirin. Perfüzyon sisteminin giriş ve çıkış uçlarını bağlayın. Perfüzyon sistemini açın ve ortam akış hızını 0,8 mL/dk'ya ayarlayın.
3. Suya daldırma hedefini dilime indirin. Parlak alan ışığıyla dilimin üst kısmına odaklanın. Uygun floresan ışığı kullanarak, CD8 T hücreleri, tümör adacıkları (EpCAM için pozitif) ve bir stroma alanı (CD90 için pozitif) içeren bir ilgi alanı seçin. Kesilen yüzeyde ve dokunun daha derinlerinde DAPI boyamasını değerlendirerek dilim içindeki hücrelerin canlılığını kontrol edin.
   NOT: Sağlıklı bir dilim, kesilen yüzeyden birkaç mikronda DAPI pozitif hücrelerin yalnızca bir azınlığını içerir.
4. Aşağıdaki eylemlerle bir görüntüleme oturumu ayarlayın.
   1. 3 floroforun floresan sinyalinin yoğunluğuna bağlı olarak, maruz kalma süresini 50 ila 800 ms arasında ve lazer yoğunluğunu %20 ila 40 arasında ayarlayın.
   2. Tümör dilimi içinde görüntülenecek z yığını kalınlığını seçin.
      not: Burada, z boyutunda toplam 60-70 μm derinliğe yayılan 10-12 optik düzlem yakalandı.
   3. İlk etiketli CD8 T hücrelerinin yaklaşık 10 μm altında başlangıç konumunu seçin.
   4. Her bir z yığını görüntüsü arasındaki zaman aralığını 10 ila 30 sn arasında ve toplam kayıt süresini 10 ila 30 dakika arasında tanımlayın.

Sonuçlar

Şekil 1: Perfüzyon sisteminin fotoğrafları. A) Fenol kırmızısı içermeyen RPMI çözeltisi %5 CO₂,% 95 O₂ bakımından zenginleştirilmiştir. B) Çözelti daha sonra peristaltik bir pompa ile perfüze edilir. C) RPMI çözeltisi, kültür kabına giriş yoluyla girer. Çıkışta, çözelti pompa tarafından hazneden bir atık kabına aspire edilir. Aspirasyon ucunun, çözelti yüksekliğini belirleyecek b...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dik konfokal mikroskop	Leica Belediyesi	Eğirme diski konfokal kullanılması önerilir
Imaris yazılımı	Bit düzlemi		Bu yazılım, görüntülerin görselleştirilmesi ve T hücresi göçünün izlenmesi için kullanılır
İnce Forseps	Dünya Hassas Aletler	14142
30 mm Kültür ekleri	Kırlangıç	PICM0RG50
Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) ortamı, GlutaMAX Takviyesi	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	61870010	Komple RPMI-besiyeri,% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal buzağı serumu ve Penisilin / streptomisin eklenerek yapılır
Fosfat tamponlu salin (PBS)	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	20012019
Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)	Canlandırıcı	14170088
Düşük jelleşme sıcaklığı Agaroz, tip VII-A	Sigma-Aldrich	A0701
Toksik olmayan butil Siyanoakrilat Tutkal, Vetbond	3 milyon	1469
Dilim ankrajlar, 19,7 çap, 2 mm aralıklı dişler	Warner Enstrümanları	64-1415
Paslanmaz çelik rondelalar, 5 mm iç çap	Amazon	B004K1FDGQ
BV605-konjuge anti-CD8 (klon SK1)	BD Biyolojik Bilimler	565289
FITC konjuge anti-EpCAM (klon HEA-125)	Miltenyi Biyotec	130-098-113
BV510 konjuge anti-CD90 (klon 5E10)	Biyoefsane	328125
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	D1306

Gazetesi Serisi arası Serisi