NOT: Bu protokol, fare biyolojik örneklerinden tohumlama aktivitesini tespit etmek için FRET akış sitometrisinin kullanımını vurgular. Ayrıca rekombinant fibriller ve insan biyolojik örnekleri ile de uyumludur. Fare ötenazisi ve beyin hasadı IACUC onaylı prosedürlere uygun olarak gerçekleştirildi.
1. Beyin Ekstraksiyonu
- İzofluran (% 2) ile derin anestezitizasyonu takiben,% 0.03 heparin içeren buz gibi soğuk PBS ile bir fareye perfüze edin ve Gage ve ark
.
- Çıkarılan dokuyu bir kriyo-şişeye yerleştirin ve sıvı nitrojen içine yerleştirerek dondurun. Alternatif olarak, dokuyu kuru buz üzerinde dondurun. Dondurulduktan sonra dokuyu -80 °C'ye aktarın ve gerekirse uzun süre saklayın.
not: Bu protokol tüm beyin homojenatları veya mikro diseke beyin bölgeleri ile uyumludur. Bkz. Hagihara ve ark.ayrıntılı bir mikrodiseksiyon protokolü için.
2. Biyolojik Tohum Materyalinin Hazırlanması
- Proteaz inhibitörlerini (etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içermez) 1x TBS'ye (Tris tamponlu salin, 10 ml'de 1 tablet) çözerek homojenizasyon tamponu hazırlayın. Kuvvetlice girdap yapın ve buz üzerinde saklayın. Proteaz inhibitörleri, biyosensör hücre canlılığını korumak için EDTA içermemelidir.
- Donmuş beyin dokusunu tek kullanımlık bir tartı teknesinde tartın ve 5 ml'lik konik bir tüpe aktarın. Buz gibi soğuk homojenizasyon tamponunu, nihai çözelti ağırlık/hacim %10 olacak şekilde ekleyin. Geçici olarak buz üzerinde saklayın. Doku kütlesi ve müteakip homojenizasyon tampon hacmi, beyin boyutuna ve/veya kullanılan bölgelere bağlı olarak değişecektir. Burada, 0.2 g ağırlığındaki yetişkin bir fare hemibrain, %10 w / hacimlik bir çözelti için 2 ml içinde süspanse edilir.
- Numuneleri soğuk bir odaya aktarın ve bir prob sonikatörünü uygun ayarlara ayarlayın. Bir Omni Ruptor (burada gösterilmiştir) ile prob sonikasyonu için, gücü yaklaşık 75 W'a karşılık gelen% 20'ye ayarlayın. Sonikasyon sırasında numunelerin aşırı ısınmadığından emin olmak için bir darbe modu kullanın. Pulseri yaklaşık 500 msn'ye karşılık gelen %30'a ayarlayın.
- Prob sonikatörünün ucunu su, izopropanol ve tekrar su ile durulayarak temizleyin ve her çözelti arasında probu silin. Probun her iki yanını ve altını laboratuvar mendilleriyle duruladığınızdan ve sildiğinizden emin olun.
- Bir seferde bir numune ile çalışarak, prob ucunu homojenizasyon tamponuna daldırın ve sonikatörü başlatın. Yukarıda açıklanan güç ve pulser ayarlarını kullanarak toplam 25 darbe verin. Dokunun tamamen süspansiyon halinde olduğundan emin olun. Bu adımda numunenin köpürmesini önlemeye dikkat edin.
not: a) toplam hacim düşükse veya b) homojenat ısınırsa numuneler köpürmeye karşı hassastır. Bu özel aletle, 250 μl'den daha düşük hacimlerde sonikasyon yapmayın. Numunelerin soğuk kalmasını sağlamak için, bu adım sırasında tüpler buz üzerinde saklanabilir.
- Kalan lizatı silerek probu temizleyin, ardından temiz su dolu bir behere 10 darbe verin. Probun yanlarını ve altını su, izopropanol ve tekrar suyla durulayın (adım 2.4'te olduğu gibi), her adım arasında silerek kurulayın. Kontaminasyonu önlemek için, numuneler arasında probu iyice durulayın.
not: Tau agregaları söz konusu olduğunda, numuneden numuneye kontaminasyonu önlemek için daha sıkı temizleme yöntemlerinin gerekli olduğunu bulamadık. Bununla birlikte, diğer amiloidler, literatürde kapsamlı bir şekilde tanımlanmış olan ek bakım gerektirebilir.
- Tüm numuneler işlenene kadar homojenatları buz üzerinde saklayın.
- 21.300 x g'da 4 °C'de 15 dakika boyunca sıkma homojenatları.
- Süpernatanı temiz bir tüpe aktarın, peleti rahatsız etmemeye dikkat edin. Peleti atın. Süpernatanı alikotlayın ve daha fazla kullanım için lizatları -80 ° C'de saklayın. Bununla birlikte, tohumlama verimliliğini azalttığı için homojenatların donma/çözülme döngülerinden kaçının.
3. Biyosensör Hücrelerinin Yeniden Kaplanması
NOT: Bu test için dört hücre satırı kullanın: HEK 293T (hücre satırı #1), RD-P301S-CFP (hücre satırı #2), RD-P301S-YFP (hücre satırı #3) ve RD-P301S-CFP/YFP (hücre satırı #4). Her hücre satırının tahlildeki katkısı için lütfen referans Tablo 1'e bakın.
- Steril bir ortamda, aspire kültür ortamı. Hücreleri ılık fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın ve aspire edin. Hücreleri (3 ml tripsin-EDTA (% 0.05)) 3 dakika boyunca tripnize edin, ılık kültür ortamı (9 ml DMEM,% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 penisilin / streptomisin,% 1 GlutaMax) ile söndürün ve hücreleri hemen konik bir tüpe aktarın.
- RT'de 5 dakika boyunca 1.000 x g'da hücreleri santrifüjleyin. Ortamı aspire edin ve hücre peletini ılık kültür ortamında yeniden süspanse edin.
- Bir hemositometre kullanarak, her hücre hattı için hücre yoğunluğunu belirleyin. Hücre yoğunluğu, hasat sırasındaki birleşme ve yeniden süspansiyon hacmine bağlı olarak değişecektir. Hücre yoğunluğunun yaklaşık 1 milyon hücre/ml olması için 10 cm'lik bir tabaktan %90 birleşimde hasat edilen hücreleri yeniden süspanse edin.
- 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğu 130 μl'lik bir ortamda 35.000 hücre içerecek şekilde bir hücre + ortam ana karışımı yapın (örneğin, 100 kuyucuk için bir ana karışım yapmak için, 13 ml'lik ortamda 3,5 milyon hücreyi yeniden süspanse edin). Hücre numarasını tek tek deneysel tasarımlara ve zaman çizelgelerine uyacak şekilde değiştirin. Kaplamadan ~ 18 saat sonra hücre tedavisi için, 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 35.000 hücre ekleyin.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak, 130 μl ana karışım hücre süspansiyonunu düz tabanlı, doku kültürü ile muamele edilmiş 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna yavaşça pipetleyin. Kaplama yaparken, pipet ucunu plakanın dibine değmeyecek şekilde kuyunun ortasına yerleştirin.
not: Kaplama formatı değiştirilebilse de, plaka başına 1-3 hücre hatlarının her biri için n = 4 kuyu yapılması önerilir. Plakanın geri kalanı (n = 84) hücre hattı #4 (biyosensör hücreleri) için ayrılmıştır.
- Plakayı RT'de 10 dakika boyunca rahatsız etmeden bırakarak hücrelerin yerleşmesine izin verin. O/N'yi 37 °C, %5 CO2 ve %≥80 bağıl nemde inkübe edin.
4. Hücreleri Tedavi Etmek
>NOT: Ertesi gün, tau biyosensör hücreleri %60-65 birleştiğinde, tohum iletim komplekslerini aşağıdaki gibi hazırlayın:
- Bir tüpte, bir ana karışım yapmak için Lipofectamin gibi transfeksiyon reaktifini Opti-MEM gibi azaltılmış serum ortamıyla birleştirin. Kuyucuk başına 1.25 μl transfeksiyon reaktifi ve 8.75 μl azaltılmış serum ortamı ekleyin. Karıştırmak, kısa bir süre döndürmek ve RT'de 5 dakika inkübe etmek için tüpü hafifçe vurun.
- Başka bir tüpte, tohum materyalini (adım 2.9'dan itibaren lizat alikotu) azaltılmış serum ortamı ile birleştirin.
not: Tohum materyalinin hacmi, bireysel deneye göre değişecektir. Tohum hacmini seçerken şunları göz önünde bulundurun: bir numunedeki tohum bolluğu ve potansiyel toksisite. Ham homojenatlar hücreler için toksik olabilir. Bu nedenle, istediğiniz efekti izlemek için mümkün olan en düşük ses seviyesini kullanın. Daha önce test edilen lizat/kuyu hacimleri, 5-20 μg toplam proteine karşılık gelen 1-5 μl arasında değişmektedir. Oyuk başına toplam hacmin (tohumlar + azaltılmış serum ortamı) 10 μl olduğundan emin olun.
- 4.1 ve 4.2'de açıklanan iki tüpten gelen içeriği birleştirin, karıştırmak için hafifçe vurun, kısaca döndürün (1.000 x g, 5 saniye) ve RT'de en az 20 dakika ve 2 saate kadar inkübe edin.
- Tek tek biyosensör kuyularının yan tarafına 20 μl transdüksiyon kompleksini nazikçe pipetleyin. Mümkünse üç teknik kopya kullanın. İşlem görmüş hücreleri 24-48 saat inkübatöre geri koyun. Adım 3.6.
'da açıklandığı gibi aynı koşullar altında inkübe edin
not: Bu kurulum için uygun negatif kontrol koşulu, boş lipozomlarla (yani, lipozom reaktifi + azaltılmış serum ortamı) muamele edilen biyosensör hücreleridir, çünkü fosfolipidlerin uygulanması, lipozom reaktifine maruz kalmayan biyosensör hücrelerine göre floresan profilinde hafif bir kaymaya neden olur.
5. FRET Akış Sitometrisi için Hücrelerin Toplanması
NOT: Hücreleri toplamadan önce - genellikle tedaviden 24-48 saat sonra - standart bir ters çevrilmiş floresan mikroskobunda yeşil floresan protein (GFP) filtresini kullanarak tohumlama aktivitesinin bir ön okumasını almak mümkündür. Tohum materyali olmadan muamele edilen hücreler (yani boş lipozomlar) diffüz floresan gösterirken, tohum materyali ile muamele edilen hücreler yoğun punktat ve retiküler hücre içi inklüzyonlar gösterecektir (Şekil 1A-B).
- Çok kanallı bir pipet kullanarak, tüm hücre ortamını (150 μl) aspire edin. Hücreleri 5 dakika boyunca tripsinize (50 μl) ve 150 μl soğutulmuş kültür ortamı ile söndürün. Bu adımda tripsinizasyondan önce bir PBS durulaması eklemeyin, çünkü hücre asansörüne ve ardından hücre kaybına neden olabilir. Geçit stratejileri aracılığıyla akış sitometrisi sırasında kirletici ölü hücreleri ve kalıntıları dışlayın.
- Su verme işleminden hemen sonra, hücreleri 96 kuyulu yuvarlak bir alt plakaya aktarın ve RT'de 5 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin.
- Hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek ortamı aspire edin ve atın.
- Nazikçe, ama iyice, hücre peletini 50 μl% 2 paraformaldehit içinde yeniden süspanse edin ve 10 dakika inkübe edin. Alternatif olarak, hücreleri canlı olarak çalıştırın, ancak fiksasyon daha temiz ve daha tutarlı sonuçlar sağlar.
- RT'de 5 dakika boyunca hücreleri 1.000 x g'da santrifüjleyin. Hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek paraformaldehiti aspire edin ve atın.
- Nazikçe, ancak iyice, hücre peletini 200 μl soğutulmuş akış sitometri tamponunda (Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS),% 1 FBS, 1 mM EDTA) yeniden süspanse edin ve hücre topaklanmasını önlemek için plakayı mümkün olan en kısa sürede çalıştırın.
6. FRET Akış Sitometrisi
NOT: FRET uyumlu lazer çizgileri ve filtre setleri ile donatılmış MACSQuant VYB gibi bir akış sitometresi kullanın (Tablo 2). Bu bölümdeki her adım için, yazılımın 96 kuyu şablonunu kullanarak ilgilendiğiniz kuyuya tıklayın ve numune alımına ve akışına başlamak için "oynat"a tıklayın. 'Yeni analiz penceresi' simgesini tıklayarak çizimler veya istatistik tabloları oluşturun. X veya Y eksenindeki başlığı tıklatarak ve uygun filtreyi seçerek tek tek iki değişkenli grafiklerdeki eksen parametrelerini değiştirin. Hücre popülasyonlarını veya floresan sinyallerini değiştirmek için uygun filtrelerle ilişkili voltajları artırın veya azaltın. Bu cihazla, doğru tek hücreli izleme sağlamak için saniyede <1.000 olay çalıştırın.
- Yan Saçılma Alanı (SSC-A) ve İleri Saçılma Alanı (FSC-A) iki değişkenli bir çizim yapın ve hücre hattı #1 çalışırken, hücre popülasyonu sol alt kadranda olana kadar SSC ve FSC voltajlarını ayarlayın. Çokgen aracını tıklatın ve hücre popülasyonunu tanımlayın (Kapı P1). Tüm geçit parametreleri için Şekil 2'ye bakın.
- FSC-H (yükseklik) ve FSC-A iki değişkenli bir çizim oluşturun ve grafiğin üzerindeki "canlı"ya tıklayarak ve P1'i seçerek bu çizime Kapı P1'i uygulayın. Hücre satırı #1 çalışırken, çokgen aracını tıklatın ve tek hücreleri tanımlayın (Kapı P2).
- İlgilenilen filtrelerin her biri için bir tane olmak üzere 3 histogram grafiği oluşturun: CFP, YFP ve FRET. Grafiklerin üzerindeki "canlı"ya tıklayarak ve P2'yi seçerek tüm bu grafiklere Kapı P2'yi uygulayın. Hücre hattı #1 çalışırken, voltajları CFP, YFP ve FRET histogramlarındaki medyan hücre popülasyonunun tümü 0 ile 1 arasında olacak şekilde ayarlayın. CFP ve FRET'i ölçmek için, hücreleri 405 nm lazerle uyarın ve sırasıyla 450/50 nm ve 525/50 nm filtre ile floresan yakalayın. YFP'yi ölçmek için, hücreleri 488 nm lazerle uyarın ve 525/50 nm filtre ile floresan yakalayın. Lazer ve filtre ayarları Tablo 2'de daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
- CFP'nin FRET ve YFP kanallarına yayılması için kompanzasyon gerçekleştirin.
not: Kompanzasyon, floresan yayılma düzeltmesi işlemidir. Floresan yayılması, başka bir florokromdan gelen sinyali ölçmek için tasarlanmış bir filtre içinde bir florokromun floresan emisyonu tespit edildiğinde meydana gelir. Uygun kompanzasyon ile, CFP yayılma floresansı FRET ve YFP kanallarından çıkarılabilir.
not: Kompanzasyon, hem floresan -pozitif hem de -negatif hücrelerin varlığını gerektirir. Bu nedenle, CFP pozitif hücreleri (hücre satırı #2) telafi etmek için, çalışmadan önce numuneye negatif hücreler (hücre satırı #1) eklenmelidir.
- Dengelemeden hemen önce 30 μl hücre hattı #1 süspansiyonunu tek bir kuyudan 200 μl hücre hattı #2 süspansiyonuna dökün.
- "Enstrüman Ayarları" simgesine, ardından 'tazminat' sekmesine tıklayın ve tazminat tablosunu açmak için 'matrisi' işaretleyin.
- FRET-A ve CFP-A iki değişkenli bir çizim yapın ve adım 6.3'te açıklandığı gibi P2 kapısını uygulayın. 1+2 hücre çizgileri çalışırken, 'kadran' simgesini tıklayın ve floresan -negatif ve -pozitif popülasyonlar alttaki iki kadranla ayrılacak şekilde kadranlar çizin (sırasıyla Gates LL3 ve LR3).
- LL3 ve LR3 geçitleri için FRET'in medyan floresan yoğunluğunu (MFI) görüntüleyen bir istatistik tablosu oluşturun. FRET sinyalinin MFI'si LL3 ve LR3 arasında eşdeğer olana kadar kompanzasyon matrisindeki FRET parametresini ayarlayın. Bu adımı takiben, FRET sinyalinin MFI'si, boyanmamış hücreler ve CFP pozitif hücreler arasında eşittir, bu da FRET kanalına CFP yayılmasının olmadığını düşündürür.
- YFP-A ve CFP-A iki değişkenli bir çizim yapın ve adım 6.3'te açıklandığı gibi P2 kapısını uygulayın. Adım 6.4.3'te yapılana benzer kadranlar (LL4 ve LR4) çizin.
- LL4 ve LR4 için YFP'nin MFI'sini görüntüleyen bir istatistik tablosu oluşturun. YFP sinyalinin MFI'si LL4 ve LR4 arasında eşdeğer olana kadar kompanzasyon matrisindeki YFP parametresini ayarlayın. Bu adımı takiben, bir YFP sinyalinin MFI'si, boyanmamış hücreler ve CFP pozitif hücreler arasında eşittir, bu da YFP kanalına CFP yayılmasının olmadığını düşündürür.
- Kapı kurulumunu ve telafisini takiben, ilgilenilen kuyuları vurgulayın ve plakanın geri kalanını çalıştırın.
- Tüm örnekler çalıştırıldıktan sonra, 'dosya'yı ve ardından 'kopyala'yı tıklayarak veri dosyalarını dışa aktarın. "Veri dosyaları" sekmesini seçin, deneme klasörünü vurgulayın ve "kopyala"yı tıklayın.
