Memeli Hücrelerinden Rekombinant Antikorların Üretimi ve Saflaştırılması

Özet

Kaynak: Shivange, Gururaj, et al. Hedef Antijene Özgü Terapötik Antikorun Tümör ve Doku Dağılımının İncelenmesi. J. Vis. Uzm.(2020).

Video, memeli konak hücrelerinde gen ekspresyonundan sekresyona kadar antikor üretme sürecini açıklıyor. Transkripsiyon, translasyon, sinyal tanıma, doğru katlamayı ve nihayetinde salgı vezikülleri yoluyla hücre dışı ortama salınmasını içerir.

Protokol

1. Antikorların ekspresyonu ve saflaştırılması

1. CHO hücrelerinin bakımı
   1. 37 ° C'de ticari olarak temin edilebilen 1x glutamin takviyesi ile desteklenmiş, 130 rpm'de %5 CO₂ ile çalkalanarak, cam veya tek kullanımlık delong Erlenmeyer şişeleri kullanılarak FreeStyle CHO Media'da CHO hücrelerini büyütün.
      not: Daha fazla çalkalama ve çalkalama koşulları sırasında gaz transferini iyileştirmek için havalandırmalı kapaklı şaşkın bir şişe kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Süspansiyon kültürünün sınırlı ajitasyonu nedeniyle düzenli şişelerle (şaşırtılmamış) önemli ölçüde azaltılmış antikor verimi elde edilmiştir.
   2. Hücre sayısını %>95 hücre canlılığı ile 1-5 x 10⁶ hücre / mL arasında tutun. Hücre sayısı 5 x 10⁶ hücre / mL'nin üzerine çıkarsa, hücreleri bölün. CHO hücrelerinin 0,2 x 10⁶ hücre / mL'nin altına ulaşmasına asla izin vermeyin.
2. CHO hücrelerinin transfeksiyonu
   1. Delong Erlenmeyer şaşkın şişelerde 200 mL ortamda (2 x 10⁶ hücre / mL) CHO hücrelerini büyütün.
      not: Şaşkın şişelerde yetiştirilen süspansiyon kültürleri, şaşkın şişelerde yetiştirildiğinde her zaman daha yüksek protein verimi üretmiştir.
   2. 15 mL'lik bir tüpte 5 mL CHO FreeStyle ortamı alın ve 50 μg VH klon DNA'sı ve 75 μg VL klon DNA'sı ekleyin. İyi karıştırmak için girdap.
   3. DNA karışımını oda sıcaklığında 5 dk.
      inkübe edin not: Daha uzun inkübasyon protein verimini azaltır.
   4. DNA çözeltisine 750 μL 1 mg / mL polietilenimin (PEI) stoğu ekleyin ve karışımı 30 saniye boyunca agresif bir şekilde girdaplayın. 5 dakika daha oda sıcaklığında inkübe edin
      not: PEI taze yapılmalıdır. PEI'nin çoklu donma çözülme döngüsü, toplam verimi önemli ölçüde azaltır.
   5. Şişeyi manuel olarak sallarken tüm DNA ve PEI karışımını hücrelere ekleyin. Delong Erlenmeyer şaşkın şişeleri 37 ° C'de hücrelerle hemen inkübe edin ve 130 rpm'de çalkalayın.
3. İfade
   NOT: Antikor, antikorların ortama salgılanmasına yardımcı olan N-terminal ucuna tasarlanmış bir salgı sinyal peptidine sahiptir.
   1. Transfekte edilmiş hücreleri 37 ° C'de, 1. günde 130 rpm'de çalkalayarak büyütün.
   2. 2. Günde, 2 mL 100x topaklanma önleyici ajan ve 2 mL 100x anti-bakteriyel-anti-mikotik çözelti ekleyin. Şişeyi 32 rpm'de çalkalayarak daha düşük bir sıcaklığa (34-130 °C) kaydırın.
   3. Her beş günde bir, 10 mL Tripton N1 beslemesi ve 2 mL 100x glutamin takviyesi ekleyin.
   4. Bir dizi hücreyi tripan mavisi lekesi ile boyadıktan sonra bir hemositometre kullanarak hücreleri her üç günde bir saymaya devam edin. Hücre canlılığının %80'in üzerinde kaldığından emin olun.
   5. 10. veya 11. günde, antikor saflaştırması için ortamı hasat edin. Kültürü 3000 x g, 4 °C'de 40-60 dakika döndürün ve ardından 0,22 μM şişe filtreleri kullanarak şeffaf ortamı filtreleyin.
4. Arıtma
   not: Antikor saflaştırması, ticari olarak temin edilebilen bir Protein-A kolonu (bkz. Malzeme Tablosu) kullanılarak, bir peristaltik pompa kullanılarak gerçekleştirilir.
   1. Sütunu iki sütunlu hacimde bağlayıcı tampon (pH 7.4'te 20 mM sodyum fosfat) ile dengeleyin.
   2. Antikor içeren filtrelenmiş ortamı (adım 1.3.5'te elde edilir) 1 mL/dk akış hızında kolondan geçirin.
   3. Sütunu iki sütunlu bir ciltleme tamponu ile yıkayın.
   4. 5 mL elüsyon tamponu (pH 3.4'te 30 mM sodyum asetat) kullanarak antikoru 500 μL'lik fraksiyonlara elute edin.
   5. Fraksiyon başına 10 μL nötralizasyon tamponu (pH 9'da 3 M sodyum asetat) ekleyerek ayrıştırılan antikorun pH'ını nötralize edin.
      not: Fraksiyon sayıları 3-6 antikorun çoğunu içerir. Antikorun beklenenden daha sonraki bir fraksiyonda ayrıştırılması durumunda tüm fraksiyonların tutulması tavsiye edilir.
   6. IgG için varsayılan protokolü seçerek bir spektrofotometre kullanarak saflaştırılmış antikor konsantrasyonunu ölçün. Antikorun nihai konsantrasyonu, moleküler ağırlık ve absorpsiyon katsayısı dikkate alınarak mg/mL cinsinden elde edilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
FreeStyle CHO ortamı	Gibco Yaşam Teknolojileri	Kedi # 12651-014
Anti-Anti (100X)	Gibco Yaşam Teknolojileri	Kedi # 15240-062
Topaklanma Önleyici Ajan	Gibco Yaşam Teknolojileri	Kedi # 01-0057DG
BD İnsülin Şırıngası	BD Biyolojik Bilimler	Kedi #329420
Kaliper IVIS Spektrumu	PerkinElmer	Kedi #124262
CHO CD EfficientFeed B	Gibco Yaşam Teknolojileri	Kedi #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium)	Corning	Kedi # 10-13-CV
Corning 500 mL dev/dak 1640	Corning	Kedi # 10-040-CV
Cy5 konjuge Anti-İnsan IgG (H + L)	Jackson İmmün Araştırma	Kedi # 709-175-149
GlutaMax-I (100X)	Gibco Yaşam Teknolojileri	Kedi # 35050-061
HiPure Plazmid Maxiprep kiti	Canlandırıcı	Kedi # K21007
HiTrap MabSelect SuRe Sütunu	GE Sağlık	Kedi # 11-0034-93
İzofluran, USP	Koy	Kedi # 11695-6777-2
Kayganlaştırıcı Göz Merhemi	Lacri-Lube'u Yenile	Kedi #4089
PEI transfeksiyon reaktifi	Termo Balıkçı	Kedi # BMS1003A
Deneysel Modeller: Hücre hatları
İnsan: OVCAR-3	Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu	ATCC HTB-161
İnsan: CHO-K hücreleri	Laboratuvarımızda stabil hale getirildi	ATCC CCL-61
Fare: 4T1	UVA'dan Dr. Chip Landen'den nazik hediye
Fare: MC38	UMBC'den Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg'den nazik hediye	STR profil oluşturma ile doğrulandı

Serisi Serisi