FA aracılı efektör fonksiyonlarının aktivasyonunun HA antikorları tarafından ölçülmesi

Özet

Kaynak: Bailey, M. J., et al. İnfluenza Hemaglutinin Spesifik Antikorları Tarafından İndüklenen Fc Aracılı Efektör Fonksiyonlarını Değerlendirme Yöntemi. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, T hücresi efektör fonksiyonlarının antikor aracılı aktivasyonunu ölçen bir testi göstermektedir. HA eksprese eden transfekte edilmiş memeli hücrelerine influenza virüsü hemaglutinin (HA) spesifik monoklonal antikorunun eklenmesi, HA ile immün komplekslerin oluşumuna neden olur. Fc reseptörlerini ve bir lusiferaz raportörünü eksprese eden tasarlanmış T hücreleri eklendikten sonra, T hücreleri antikor-HA kompleksleri tarafından aktive edilir ve bu aktivasyon, bir lusiferaz substratı eklenerek ve üretilen biyolüminesans ölçülerek tespit edilir.

Protokol

1. İnfluenza Virüsü Hemaglutinin'in Transfeksiyon Yoluyla İfadesi

1. Plaka İnsan Embriyonik Böbrek (HEK 293T) hücreleri 2 x 10^{yoğunlukta 4} hücre/kuyu beyaz doku kültürü ile muamele edilmiş 96 oyuklu plaka ve 37 °C inkübatörde (% 5 CO₂ ile) 4 saat bekletin.
2. Toplam 50 μL.
   hacminde viral hemaglutinin ve oyuk başına 0.2 μL transfeksiyon reaktifi için 100 ng DNA kodlayan transfekt hücreler not: Hem plazmid hem de transfektant reaktif, 1x Opti-Minimum Esansiyel Ortam (MEM) İndirgenmiş Serum Ortamında seyreltilir.
3. Plakaları 37 ° C'lik bir inkübatörde 18 saat boyunca% 5 CO₂ ile inkübe ettikten sonra, transfeksiyon ortamını çıkarın.

2. Monoklonal Antikorlar veya Sera ile Lusiferaz Aktivitesinin FcRg/NFAT Aracılı Aktivasyonunun Değerlendirilmesi

1. İlk olarak, transfekte edilmiş hücrelerin büyüme ortamını 25 μL tahlil ortamı ile değiştirin (% 4 (hacim / hacim) düşük IgG fetal sığır serumu ile desteklenmiş 1x RPMI 1640).
2. Ayrı bir 96 oyuklu plakada, tahlil ortamını kullanarak 30 μg / mL'den başlayarak ilgilenilen antikorların dört kat seyreltmesini gerçekleştirin. Seyreltmeleri üç kopya halinde gerçekleştirin ve örnek bir plaka düzeni Şekil 1A'da gösterilmiştir. Antikorları dışlayan bir kontrolün (antikor kontrolü yok) ve bir arka plan kontrolünün (tek başına tahlil tamponu) dahil edildiğinden emin olun.
   not: Hem 'antikor yok' hem de arka plan kontrolleri için, antikor yerine 25 μL test tamponu ekleyin.
3. Seri olarak seyreltilmiş antikorların 25 μL'sini Adım 2.2'den transfekte edilmiş hücrelerin plakası üzerindeki karşılık gelen kuyucuklara aktarın.
4. Plakayı 37 ° C'lik bir inkübatörde (% 5 CO₂ ile) 15 dakika inkübe edin.
5. Murin FcgRIV veya insan FcgRIIIa'yı (75.000 hücre / kuyu) eksprese eden uygun modifiye efektör Jurkat hücresinden 25 μL ekleyin. Her bir kuyucuk için toplam hacim 75 μL olmalıdır ve antikorun başlangıç nihai konsantrasyonu 10 μg/mL'dir (Şekil 1B).
   not: Arka plan kontrolü için, efektör hücreler yerine 25 μL tahlil tamponu ekleyin. Antikora bağımlı hücre aracılı fagositozu incelemek için, insan FcgRIIa'sını eksprese eden modifiye edilmiş bir Jurkat hücresi kullanılabilir.
6. Plakayı 37 ° C'lik bir inkübatörde 6 saat boyunca% 5 CO₂ ile inkübe edin.
7. Kullanmadan önce lusiferaz substrat tamponunu 37 °C suda yaklaşık 1 saat çözdürün ve ısıtın.
   not: Lusiferaz substrat tamponunu yapmak için, sağlanan tahlil tamponunda liyofilize lusiferaz tahlil substratını yeniden oluşturun. Sulandırılmış substrat tamponu, -30 °C ila -10 °C arasında altı haftaya kadar saklanabilir.
8. Arka plan kontrolü dışındaki tüm kuyucuklara 75 μL/kuyu lusiferaz substrat tamponu ekleyin.
9. Bir luminometrede okuyun.
10. Aşağıdaki denklemle katlama indüksiyonunu hesaplayın: Katlama indüksiyonu = (İndüklenen değer-Arka plan değeri) / (mAb değeri yok-Arka plan değeri).

Sonuçlar

Şekil 1: Deney gruplarının örnek plaka düzeninin ve bileşiminin şeması. (A) Her bir antikor numunesi için başlangıç konsantrasyonu 10 μg/mL'dir ve plaka boyunca (kolon 1'den kolon 12'ye) 4 kat seri olarak seyreltilir. Her numune üç nüsha halinde yapılır. G Satırı mAb yok denetimi için ayrılmıştır ve H Satırı arka plandır. (B) Lusiferaz substrat tamponu eklenmeden önce...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
HEK 293T hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	CRL-3216	İnsan embriyonik böbrek hücreleri
Lipofektamin 2000	Yaşam Teknolojileri	11668019	Transfeksiyon reaktifi
1X Opti-MEM Azaltılmış Serum Ortamı	ThermoFisher Bilimsel	51985-034
Beyaz doku kültürü ile tedavi edilmiş 96 oyuklu plak	Corning, Inc.	3917	Tahlil plakaları
10 KAT MEM	Gibco (Gibco)	11430-030
Murin FcgRIV eksprese eden Jurkat hücresi	Promega	M1201	Kit, hücreler, Bio-Glo Luciferaz test sistemi, 1X RPMI ve düşük IgG serumu içerir
İnsan FcgRIIIa eksprese eden Jurkat hücresi	Promega	G7010	Kit, hücreler, Bio-Glo Luciferaz test sistemi, 1X RPMI ve düşük IgG serumu içerir
İnsan FcgRIIa'yı eksprese eden Jurkat hücresi	Promega	G9901	Kit, hücreler, Bio-Glo Luciferaz test sistemi, 1X RPMI ve düşük IgG serumu içerir
Aydınlatma Ölçer	BioTek	Synergy H1 Çok Modlu okuyucu	Lüminesans plaka okuyucu
Bio-Glo Luciferase Test Sistemi	Promega	G7940	Lusiferaz tahlil tamponu ve lusiferaz tahlil substratı içerir