Nötralize Edici Antikorlara Karşı İnfluenza Virüsü Kaçış Varyantlarının Üretilmesi

>NOT: Viral replikasyonu inhibe eden HA'ya özgü antikorlar genellikle i) küresel başın üstündeki reseptör bağlanma bölgesine veya bitişiğine bağlananlar ve ii) küresel başın lateral tarafını ve HA'nın sap bölgesini içeren reseptör bağlanma alanının distalini bağlayanlar olarak kategorize edilebilir. Reseptör bağlanma bölgesini hedef alan antikorlar, sialik asit motiflerinin hedef hücrelerin yüzeyine yapışmasını önler ve bir hemaglutinasyon inhibisyonu (HI) testi kullanılarak ölçülebilir. Sap spesifik antikorlar gibi HI negatif olan antikorlar hala viral replikasyonu inhibe edebilir, ancak yalnızca nötralizasyon testleri kullanılarak değerlendirilebilir.

1. Antikorları HI Aktivitelerine Göre Sınıflandırma

1. HI testi
   1. 96 oyuklu bir V tabanlı plakada, 2 ila 12 numaralı sütunlara 25 μL 1x PBS ekleyin.
   2. Monoklonal antikoru (mAb) 7B2 (başa özgü), 6F12'yi (sapa özgü) ve izotip kontrolünü 1x PBS'de 100 μg / mL'ye seyreltin ve seyreltilmiş antikor preparatlarının 50 μL'sini kolon 1'e ekleyin. Ayrıca, 50 μL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyerek mAb kontrolü içermez (Şekil 1A).
   3. 25 μL'yi kolon 1'den kolon 2'ye aktararak antikorların 2 kat seri dilüsyonlarını gerçekleştirin ve bu şekilde devam edin. Son 25 μL'yi sütun 12'den atın (Şekil 1A).
      not: Antikor kontrolü olmayan bir satır eklediğinizden emin olun.
   4. Virüs stoğunu (A/California/04/09'un hemaglutinin (HA) ve nöraminidazı (NA) A/Porto Riko/8/34'ün iç segmentleri ile eksprese eden bir reassortant virüs) 8 hemaglutinasyon ünitesi/25 μL seyreltilmiş virüs stoğuna seyreltin. Her oyuğa 25 μL seyreltilmiş virüs stoğu (8 hemaglutinasyon) ekleyin (Satır A ila G).
      not: Antikor ve virüs karışımı, 50 μg/mL'lik bir başlangıç nihai konsantrasyonu ile 50 μL'lik bir nihai hacme sahip olmalıdır.
   5. Plakayı oda sıcaklığında (RT) 45 dakika inkübe edin.
   6. Geri titrasyon sırası (H) için, H2 ila H12 kuyularına 50 μL 1x PBS ekleyin. H1 kuyusuna 8 hemaglutinasyon ünitesinin 100 μL'sini / 25 μL'yi ekleyin. 50 μL'yi H1'den H2'ye aktararak seri olarak iki kat seyreltin ve bu şekilde devam edin. Son 50 μL'yi H12 kuyusundan atın. Son olarak, 96 oyuklu V-alt plakanın tüm kuyucuklarına 50 μL% 0.5 tavuk kırmızı kan hücresi (RBC) ekleyin.
      not: Testteki mAb numunelerinin nihai hacmi 100 μL'dir: mAb (25 μL), virüs (25 μL) ve RBC (50 μL). mAb içermeyen kontrolün son hacmi 25 μL 1x PBS, 25 μL virüs ve 50 μL RBC içermelidir.
   7. Plakayı 4 °C'de 1 saat inkübe edin.
   8. HI aktivitesi için plakaları görsel olarak okuyun. Belirli bir antikor için pozitif bir okuma varsa, kaçış varyantları oluşturmak için adım 2.1'e geçin. Antikor HI-negatif ise, antikorun bir hücre kültürü testinde nötralize edici aktiviteye sahip olup olmadığını değerlendirmek için aşağıdan adım 1.2'ye geçin.
      not: Bir HI-aktif mAb'nin pozitif bir okuması, 96 oyuklu V-alt plakası 45°'lik bir açıyla tutulduğunda bir gözyaşı damlası oluşturacak olan bir kuyunun merkezinde (Şekil 1B; 7B2) koyu kırmızı bir RBC peleti ile gösterilir. Negatif bir okuma, kuyuda koyu kırmızı bir RBC peleti oluşturmayacaktır (Şekil 1B; 6F12 ve mAb yok). İzotip kontrolü ayrıca koyu kırmızı bir RBC peleti oluşturmayacak ve sapa özgü antikor, 6F12 veya mAb içermeyen kontrol numunesi ile aynı görünmelidir (Şekil 1B).

2. Escape Mutant Varyantlarının Üretilmesi

>NOT: HI aktivitesine sahip olan veya olmayan nötralize edici antikorlar, aşağıda açıklanan spesifik protokollerle daha fazla analiz edilir.

1. Protokol 1: HI-pozitif/Nötralizasyon-pozitif antikorlar (Şekil 2A)
   1. 400 μL hacimde 1x PBS'de 10⁶ plak oluşturan birim/mililitre (PFU/mL) bir virüs stoğu hazırlayın.
   2. Artan konsantrasyonlarda ilgilenilen antikorun dört dilüsyonunu hazırlayın (ör., 0.5, 0.05 ve 0.005 mg / mL) 1x PBS'de seyreltme başına 100 μL'lik bir hacimde.
      NOT: Vahşi tip virüs her zaman paralel olarak ve antikor yokluğunda geçilmelidir. Bu pasajlı virüslerin dizileri, hücre kültürü koşullarına adaptasyon ile kaçış mutasyonları arasında ayrım yapmaya yardımcı olacaktır.
   3. 100 μL 10⁶ PFU/mL virüsü 100 μL her antikor seyreltmesi veya 100 μL 1x PBS ile karıştırın.
   4. 37 ° C'lik bir inkübatörde 1 saat inkübe edin (% 5 CO₂ ile). Kısaca girdap. Her karışımdan 200 μL'yi spesifik patojen içermeyen (SPF) embriyonlu tavuk yumurtalarına enjekte edin.
   5. Yumurtaları 37 °C'de (CO₂ olmadan) 40-44 saat kuluçkaya yatırın.
   6. Virüs bulaşmış embriyonlu yumurtaları 4 ° C'de en az 6 saat kuluçkaya yatırarak kurban edin.
   7. Allantoik sıvıyı daha önce tarif edildiği gibi yumurtalardan toplayın.
   8. Hemaglutinasyon testini yukarıda tarif edildiği gibi gerçekleştirin. Tüm allantoik sıvı preparatlarında hemaglutinasyon titreleri yoksa, 0.005 mg / mL ila 0.00005 mg / mL arasında değişen antikor dilüsyonları ile 2. adımdan itibaren tekrarlayın.
      not: HI-pozitif bir antikorun doymuş bir konsantrasyonu, mevcut tüm virüs partiküllerini nötralize edebilir. Bu nedenle, geçişte mevcut olan antikor miktarını azaltmak gerekebilir.
   9. HI testini gerçekleştirerek kaçış varyantlarını onaylayın (adım 1.1).
      not: HI-aktif antikorlar, sialik asit motiflerinin hedef hücreler üzerindeki HA katılımını bloke eder. Bu nedenle, aynı kökenli antikorun varlığında bir virüs, RBC'leri aglütine etme yeteneğini kaybeder (RBC peletinin varlığı). Teorik olarak, HI-aktif antikorların kaçış varyantları, aynı kökenli antikorun varlığında bile sialik asit motiflerini bağlayabilir ve böylece RBC'leri aglütine edebilir (RBC peleti yok). İlgilenilen antikorun HI'sı hala tespit edilebiliyorsa, antikorun daha yüksek bir başlangıç konsantrasyonu ile adım 2.1.2'deki protokolü tekrarlayın.

Şekil 1: HI testi. (A) 96 oyuklu bir V-alt plaka kullanılarak iki fare H1'e özgü mAbs 7B2 (başa özgü) ve 6F12'nin (sapa özgü) aktivitesini test etmek için bir HI testinin ayarlanması için bir şema ve (B) bir HI testinin sonuçlarına bir örnek

Resim 2: Kaçış mutantlarının oluşumu. Önerilen metodoloji, HI ve antikor tarafından sergilenen mikronötralizasyon aktivitesine bağlı olacaktır. (A) nötralize edici HI-pozitif antikorlara karşı kaçış mutantlarının oluşumu, yumurtalarda tek bir pasaj gerektirebilirken, (B) nötralize edici HI-negatif antikorlar, hücre dokusu kültüründe artan antikor miktarları ile çoklu pasajları içerebilir.