Memeli Hücre Kültürlerinden Rekombinant Monoklonal Antikorların Üretilmesi

Özet

Kaynak: Nogales-Gadea, G. et al., Ölümsüzleştirilmiş Sıralanmış B Hücrelerinden Rekombinant İnsan IgG Monoklonal Antikorlarının Üretilmesi.J. Vis. Uzm.(2015)

Bu video, ağır ve hafif zincir genlerine sahip plazmit vektörlerini tanıtarak memeli hücrelerinden antikor üretme yöntemini göstermektedir. Bu vektörler polietilenimin ile etkileşime girer ve polipleksler oluşturarak hücrelere girer; Daha sonra, tek tek proteinlere çevrilirler ve hücre dışı ortama salgılanan tam antikorlara birleştirilirler.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin (PBMC'ler) İzolasyonu

1. Kan alımından sonra mümkün olan en kısa sürede katılımcıların heparinize kanının 25 ml'sini 900 x g'da 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Daha az kan varsa, reaktifleri buna göre küçültün. Sonraki tüm adımları bir başlıkta gerçekleştirin.
2. Serumu temiz bir tüpe aktarın. PBMC'lerin dondurulması için daha sonraki adımlarda veya otoimmün hastalarda oto-antikorları test etmek için kullanılabilir.
3. Kanı 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 besiyeri ile seyreltin ve hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin.
4. 50 ml'lik yeni bir tüpe 15 ml polisakaroz ve sodyum diatrizoat (1.077 g / ml) içeren bir çözelti ekleyin.
5. İki sıvı çok yavaş temas edene kadar tüplerin iki açıklığını birbirine yaklaştırarak adım 1.4'te kanı solüsyonun üzerine nazikçe yerleştirin ve ardından PBMC süspansiyonunu 50 ml'lik tüpün üzerine yavaşça boşaltın. Bu adım, PBMC'lerin iyi bir şekilde ayrılması için kritik öneme sahiptir.
6. Adım 1.5'te elde edilen tüpü oda sıcaklığında (RT) 20 dakika boyunca frensiz olarak 400 x g'da santrifüjleyin.
7. Santrifüjlemeden sonra, PBMC'leri içeren tüpün orta kısmında görünen beyaz halkayı pipetle geri kazanın.
8. Hücreleri 25 ml RPMI 1640 ortamı ile yıkayın.
9. RT'de 300 x g'yi 10 dakika santrifüjleyin.
10. Süpernatanı atın ve hücreleri 10 ml RPMI 1640 ile yıkayın. Adım 1.9'daki gibi tekrar santrifüjleyin.
11. PBMC'leri daha önce bildirildiği gibi bir Neubauer odası ile sayın.
12. PBMC'leri bölüm 2'deki gibi işleyin veya daha sonra kullanmak üzere aşağıdaki gibi saklayın: 1 ml %10 dimetil sülfoksit (DMSO) ve adım 1.2'de elde edilen %90 serum içinde seyreltilmiş Kriyoviyal tüp başına dondurma için 10 milyon PBMC. Aşamalı olarak ve sıvı nitrojen içinde uzun süre saklamak için dondurun.

2. CD22+ ve immünoglobulin G'yi (IgG+) Hücre Sitometrisi ile Sıralamak için PBMC'lerin Boyanması

1. PBMC'leri 25^cm2'lik bir hücre kültürü şişesinde 6 ml tam RPMI 1640 ortamı (L-glutamin, 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) tamponu, 50 U / ml penisilin, 50 μg / ml streptomisin ve% 10 fetal sığır serumu) ile kaplayın ve inkübatörde 37 ° C'de% 5 karbondioksitte (CO₂) O / N'yi geri kazanmalarına izin verin.
2. Steril floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) tüplerini gece boyunca steril% 4 albümin fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi (O / N) ile bloke edin. Tüpleri PBS ile iki kez yıkayın ve 500 μl tam RPMI 1640 ortamı ile doldurun. Sıralamadan sonra hücreleri geri kazanmak için bu tüpleri kullanın.
3. PBMC'leri bir tüpte toplayın ve RT'de 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
4. Etiketleme arabelleğindeki hücreleri yeniden askıya alın (bkz. adım 2.5 ve 2.6) ve sayın. Etiketleme tamponu, PBS'de steril% 2 fetal sığır serumu ve 1 mM etilendiamintetraasetik asittir (EDTA).
5. Her biri 10⁵ hücreli 3 FACS tüpü hazırlayın ve bunları 100 μl etiketleme tamponunda yeniden süspanse edin. Bu tüpler, sıralamanın kapılarını tanımlamaya hizmet edecektir.
   1. İlk tüpe 5 μl anti CD22 PerCP antikoru (üreticinin veri sayfasında önerilir), ikinci tüpe 20 μl anti IgG PE (üreticinin veri sayfasında önerilir) ekleyin ve üçüncü tüpe hiçbir şey eklemeyin. 30 dakika boyunca buz üzerinde ve karanlıkta inkübe edin.
6. Bir FACS tüpünde 200 μl etiketleme tamponunda 5 milyon hücreyi yeniden süspanse edin ve 10 μl anti CD22 PerCP ve 40 μl anti IgG PE ekleyin. Hücreleri 30 dakika boyunca buz ve karanlık üzerinde inkübe edin. Daha fazla sayıda hücrenin sıralanması isteniyorsa, tüm reaktifleri ölçeklendirin.
7. RT'de 5 dakika boyunca düşük frenli 400 x g'da hücreleri santrifüjleyin.
8. Süpernatanı yumuşak bir şekilde boşaltın.
9. Hücreleri 500 μl etiketleme tamponunda yeniden süspanse edin. RT'de 5 dakika boyunca düşük frenleme ile hücreleri 400 x g'da santrifüjleyin. 2.7 ve 2.8 adımlarını tekrarlayın
10. Süpernatanı yumuşak bir şekilde boşaltın ve hücreleri 300 μl RPMI tam ortamda yeniden süspanse edin.
11. Hücreleri 0,45 μm'lik bir filtreden geçirin. Hücreler sıralamaya hazırdır.

3. B Hücrelerinin Sıralanması CD22+ ve IgG+

1. Hücrelerin canlılığını belirlemek için 3 kontrol tüpü kullanın. Boyama olmayan kontrolde, lenfosit kapısını tanımlamak için ileri ve boyut dağılım grafiğini kullanın. CD22 PerCP ve anti-IgG PE ile yapılan kontroller, kapıların ve ayırma kapısının oluşturulmasına hizmet eder. Daha önce bildirilen verileri takip edin.
   NOT: Bir geçit, bizim durumumuzda hücrelerde belirli bir sitometrik olay grubunu büyük bir kümeden izole etmeye yarayan bir dizi değer limitidir (sınırlar). Bir sıralama kapısı söz konusu olduğunda, değer limitleri, tanımlanan sınırların içinde bulunan sitometrik olayların, hücrelerin geri kazanılmasına izin verir: CD22 + ve IgG +.
2. Ayırmada bir toplama tüpü olarak, adım 2.2'den elde edilen 500 μl tam RPMI 1640 ortamı ile tıkalı tüpleri kullanın.
3. Çift pozitifi sıralamaya devam edin: CD22 + IgG +. HER KOŞULDAKI SON HÜCRE SAYISINI NOT EDIN. Plaka, hücreleri mümkün olan en kısa sürede besleyici hücrelerin üzerine sıraladı.

4. Besleyici Hücrelerin Işınlanması

NOT: Besleyici hücrelerin hazırlığını, sıralamadan 1 - 3 gün önce gerçekleştirin. 96 yuvarlak kuyulu bir plakada kuyu başına en az 5.000 wi38 hücresine ihtiyaç vardır. Bir başlıkta 4.1, 4.2 ve 4.4 adımlarını gerçekleştirin.

1. Wi38 hücrelerini 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de tam RPMI 1640 ortamında (PBMC'ler için olduğu gibi) istenen hücre sayısına ulaşılana kadar yetiştirin.
2. Daha önce açıklanan bir protokolü izleyerek onları 50 Gri'de ışınlayın. Wi38 hücreleri tripsinizlendikten ve tam RPMI ortamında yeniden süspanse edildikten sonra veya wi38 kültür şişesine bağlı ve ışınlamadan sonra tripsinlenmiş olarak ışınlama gerçekleştirin. Wi38 hücrelerinin tedarikçisi tarafından belirtilen tripsinizasyon yöntemini izleyin. IgG + B hücrelerini kaplamak için gereken kuyucukları kaplamak için gerekli hücre sayısını ışınlayın (adım 1.11'de sayılan toplam PBMC'nin %1'i).
3. 96 yuvarlak kuyucuklu plakanın her bir oyuğunda 5.000 ışınlanmış wi38 hücresi içeren plaka 90 μl. Plakanın dış sırasındaki kuyucukları boş bırakın (çünkü daha hızlı buharlaşırlar) ve hücreleri kaplamak için yalnızca plakanın ortasındaki 60 kuyuyu kullanın. Plakayı çerçeveleyen dış kuyucukları 200 μl PBS ile doldurun.
4. İhtiyaç duyulana kadar 37 °C'de% 5 CO_2'de bir inkübatöre yerleştirin.

>5. Kaplama, Sıralanmış PBMC'ler, Epstein-Barr Virüsü (EBV) Enfeksiyonu ve Büyümesi

1. Sıralanan PBMC'leri, 96 yuvarlak kuyucuk plakasında (daha önce wi38 ışınlanmış hücrelerle kaplanmış) oyuk başına 50 μl RPMI 1640 tam ortamda 50 hücreyi plakalamak için seyreltin. EBV çalışması için donatılmış bir davlumbazda adımları gerçekleştirin.
   NOT: Kuyucuk başına 50 hücrenin enfeksiyonu optimize edilmiştir ve bir monoklonal antikor üretme olasılığını arttırır, ancak bunun daha önce tarif edildiği gibi polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile doğrulanması önerilir.
2. 96 yuvarlak kuyucuk plakasındaki her bir oyuğa 60 μl EBV süpernatan (3 - 4 x 10⁸ viral kopya / ml içeren) ekleyin. EBV çalışması sırasında DİKKAT alınmalıdır.
3. Kuyucuk başına 1 μg/ml CpG (ODN2006) ekleyin.
4. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO_2'de bir inkübatörde bırakın.
5. Bir hafta sonra mikroskop altında büyüyen klonu görsel olarak izleyin.
   NOT: B hücresi büyümesinin bazı örnekleri aşağıdaki sonuçlar bölümünde görülebilir. Klonların büyüme oranlarının değişebileceğine ve kuyunun ortasında büyüyen bir hücre kütlesinin başladığını görmeye başlamak için fazladan zamana ihtiyaç duyulabileceğine dikkat edin.
6. 1. iki hafta sonra, ışık mikroskobu altında büyüyen klonu izleyin ve ilk medya değişimine geçin. Kuyunun üst kısmından 90 μl ortamı yavaşça pipetleyin ve 96 oyuklu temiz bir plakada toplayın. (B hücreleri kuyunun dibinde bulunur, bu nedenle onları aspire etme riski yoktur).
   1. Her oyuğa 1 μg/ml CpG (ODN2006) ve 50 U/ml IL2 ile desteklenmiş 100 μl tam RPMI 1640 ortamı ekleyin. Klonlar büyüyorsa, bu ilk medya değişimini 6. adımdaki gibi enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile analiz edin.
7. 90 μl ortam alarak ve 1 μg/ml CpG (ODN2006) ve 50 U/ml IL2 ile desteklenmiş 100 μl tam RPMI 1640 ortamı ekleyerek tekrar büyümenin 3. ve 4. haftasından sonra klon büyümesini izleyin ve ortamı değiştirin. Adım 6.
   'da olduğu gibi ELISA ile IgG üretimini izlemek için toplanan süpernatanı kullanın. NOT: Bir ay sonra klon büyümesi, genellikle yuvarlak dip kuyusunun ortasında yer alan yuvarlak hücre agregalarını gözlemleyerek belirgin olmalıdır.
8. Bu adımda, medyayı önceki haftalarda olduğu gibi değiştirin, ancak yalnızca tam RPMI 1640 medyasıyla. Medyayı değiştirmek için doğru anı bilmek için iyi bir gösterge medya rengidir, eğer sarımsı hale geliyorsa, hücrelerin bir medya değişimine ihtiyacı vardır.
9. 96 oyuklu plakalar büyük klonlar (yaklaşık 5 x 10⁵ hücreli) içerdiğinde, bunları 24 oyuklu bir plakanın düz bir kuyusuna aktarın. Yeni kuyuya 300 μl tam RPMI 1640 ortamı ekleyin. 96 oyuklu büyüyen klonu birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin ve hücreleri homojen bir şekilde dağıtarak yeni kuyuya aktarın. Gerektiğinde yeni medya ekleyin.
   1. 24 oyuklu plakanın kuyuları hücrelerle dolu olduğunda (yaklaşık 5 x 10⁶ hücreli), 6 oyuklu bir plakanın düz bir kuyusuna aktarın. Yeni kuyucuğa 2 ml tam RPMI 1640 ortamı ekleyin. 24 oyuklu plakadaki hücreleri birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek tekrar süspanse edin ve yeni kuyucuğa homojen bir şekilde dağıtın.
10. Gerektiğinde medya ekleyin. Hücreler kültürde tutulmayacaksa, hücreleri RT'de 5 dakika boyunca 400 x g'da peletleyin. Süpernatanları ELISA testi için saklayın. Hücre peletini 1 x PBS ile bir kez yıkayın, 400 x g'da 5 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin ve RNA ekstraksiyonuna kadar -80 ° C'de kuru olarak saklayın.
    1. 6 oyuklu plakadaki hücreler birleştiğinde (yaklaşık 20 x 10⁶ hücre), 60 mm'lik bir kültür plakasına aktarın. Yeni plakaya 4 ml tam RPMI 1640 ortamı ekleyin. Hücreleri 6 oyuklu plakada yeniden süspanse edin ve bunları 5.9 ve 5.10 adımlarında olduğu gibi aktarın.
11. Gerektiğinde yeni medya ekleyin. Bu adımda, hücreleri %90 fetal buzağı serumu ve %10 DMSO'da 10 – 30 milyon / ml'de dondurun. Daha büyük miktarlarda hücre isteniyorsa, klonların daha büyük yüzey plakalarında genişlemeye devam edin.

>6. IgG Antikor Tespiti için ELISA

1. Kaplama tamponunda 1 200 oranında seyreltilmiş keçi F (ab) ₂ anti-insan Fc antikorunun bir ELISA plakasında 50 μl / kuyu dağıtın. Kaplama tamponu 50 mM sodyum karbonat (_Na2CO3) pH9.6 içerir.
2. Plakaları plastik bir etiketle kapatın ve 37 °C'de 1 saat inkübe edin. Alternatif olarak, 4 °C O/N'de inkübe edin.
3. Her kuyuyu 200 μl yıkama tamponu ile 6 kez yıkayın. Yıkama tamponu 1 x PBS'de %0,05 Tween-20 içerir. Antikorun bağlandığı kuyu yüzeyine dokunmayın veya çizmeyin.
4. Blokaj tamponlu blok, 100 μl/kuyu. Bloke edici tampon, PBS'de yağsız kuru sütün %4'ünü içerir. Plakayı kapatın ve 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
5. Yıkamayın. Bloke edici tamponu atın ve kalan sıvıyı çıkarmak için plakayı bir kağıt havlu üzerine 3 kez baş aşağı vurun.
6. Klonların süpernatantlarını ve standartlarını kuluçkaya yatırın.
   1. İlk test için, RPMI'de adım 5.6 veya 5.7 1/3'te elde edilen klon süpernatantları seyreltin. Standartlar için: 1.000 ng / ml, 500 ng / ml, 250 ng / ml, 125 ng / ml, 62.5 ng / ml, 31.25 ng / ml, 15.6 ng / ml ve boş elde etmek için RPMI orta insan IgG çözeltisi ile seyreltin. 50 μl/kuyucuk kullanın ve 37 °C'de 60 dakika inkübe edin. 1/10 veya 1/100 gibi antikor afinitesini test etmek için klonun süpernatantının daha fazla seyreltmesini analiz edin.
7. Adım 6.3'te yapıldığı gibi yıkayın.
8. İnkübasyon tamponunda 1: 20.000 oranında seyreltilmiş konjuge keçi F (ab) 2 anti-insan IgG Fc peroksidaz kullanın. İnkübasyon tamponu, 1x PBS'de %1 sığır serum albümini (BSA) ve %0.02 Tween 20 içerir. 37 °C'de 60 dakika inkübe edin.
9. Adım 6.3'te yapıldığı gibi yıkayın.
10. % 0.1 3,3 ', 5,5'-Tetrametilbenzidin (TMB) içeren 100 μl / kuyu substrat çözeltisi ekleyin. Kuyucuklarda sabit bir mavi renk oluşana kadar 10 dakika inkübe edin. Dikkat et; Çok uzun süre beklemeyin!
11. 50 μl 2 M sülfürik asit (H₂S₄ ) ekleyerek reaksiyonu durdurun. Reaksiyonu durdurduktan sonra 30 dakika içinde emilimi 450 nm'de ölçün.
    NOT: Boşluk üzerinde 3 standart sapmaya sahip tüm klonların süpernatantları, IgG insan antikorları için pozitif olarak kabul edilecektir. Pozitif klonların doğrulanması için, bu ELISA aynı klonun farklı süpernatantlarında en az üç kez tekrarlanmalıdır. Ayrıca, süpernatantlar kaplanmamış ancak tıkanmış kuyucuklarda inkübe edildiğinde sinyal olmadığından emin olmak için spesifik olmayan çapraz reaktivite olasılığını atmak için önerilir. Bu adımda, bölüm 7'ye geçmeden önce, ilgilenilen antikorların antijenik özgüllüğünü taramak için bir tespit testi gerçekleştirilebilir.

>7. Üreten IgG Klonlarının RNA İzolasyonu ve Birinci İplikli Tamamlayıcı DNA (cDNA) Sentezi

1. IgG üretimi ELISA tarafından onaylanır onaylanmaz, klonun RNA'sını çıkarın.
2. Adım 5.7 veya 5.9'da büyüyen hücrelerden RNA'yı çıkarmak için, 10.000 hücreden bir hücreye DNA elde edilmesine izin veren üst simge III hücreleri doğrudan cDNA sentez kitini kullanın.
3. Daha büyük miktarlarda hücreden veya adım 5.11'de depolanan peletten RNA'yı çıkarmak için yüksek saflıkta RNA izolasyon kitini kullanın. Diğer RNA ekstraksiyon sistemleri de bu adımda uygun olabilir. Üreticinin talimatlarını izleyin.
4. 1 x 10⁶ ve 1 x 10⁴ arasındaki hücre numaraları için, üreticinin talimatına uyarak ters transkripsiyon sistemini kullanın. İlk iplikçik cDNA sentezi için başka sistemler de kullanılabilir.

8. IgG Üreten B Hücresi Klonlarının Ağır ve Hafif Zincirlerinin Amplifikasyonu için 1. ve 2. PCR

1. Adım 5.6 ve 5.7'de elde edilen ve adım 6'da IgG ELISA'da pozitif olan hücre klonlarının cDNA'sı ile, Tablo 1'de listelenen primerlerle PCR gerçekleştirin.
2. Her IgG heavy, kappa ve lambda zinciri için bağımsız PCR'ler ayarlayın. Eşit konsantrasyonlarda ileri ve geri astarlarla bir stok çözeltisi yapın. Bunları 0.4 μM nihai konsantrasyonda reaksiyona ekleyin.
3. 1^ST PCR'yi gerçekleştirmek için 1 μl cDNA sentezi kullanın. Burada, Takara Taq üretici talimatlarını kullanarak 20 μl reaksiyon gerçekleştirin. Alternatif olarak, diğer polimerazları kullanın.
4. 1. PCR'yi aşağıdaki döngü koşulları altında yerleştirin: 94 dakika boyunca 5 °C; (50 döngü: 30 saniye boyunca 94 °C; 30 saniye boyunca 58 °C ve 45 saniye boyunca 72 °C; 7 dakika boyunca 72 °C; 4 ° C'de soğumaya bırakın.
5. 1x TBE (89 mM Tris-borat ve 2 mM EDTA) hazırlayın. 100 ml 1x TBE hacminde 1 g agaroz (% 1 agaroz jeli) ekleyin. Çözeltiyi mikrodalgada agaroz eriyene kadar yaklaşık 1 dakika ısıtın. Daha sonra 4 μl 10 mg/ml etidyum bromür (veya eşdeğer DNA boyası) ekleyin ve karıştırın.
   1. İçeriği bir tepsiye dökün ve polimerize olana kadar bekleyin. Bantları görselleştirmek için jelde 5 μl PCR karışımı çalıştırın. Ağır zincir parçaları 400 - 550 bp civarında, hafif zincir ise 300 - 400 bp civarında olmalıdır. Bantlar tespit edilmezse, aynı şekilde 2. PCR'ye geçin.
6. 2. PCR'yi gerçekleştirmek için ilk PCR karışımından 1 μl kullanın. Adım 8.2'deki reaktiflerin aynısını kullanın, ancak uygun primer karışımını kullanın (bakınız Tablo 1). 2^. PCR için aşağıdaki koşulları kullanın: 5 dakika boyunca 94 ° C; (50 döngü: 94 °C 30 saniye; 56,5 °C 30 saniye ve 72 °C 55 saniye); 72 °C'de 7 dakika; 4 °C'de soğumaya bırakın. Olası PCR kontaminasyonlarını tespit etmek için reaksiyona bir boşluk ekleyin.
7. 8.5'te tarif edildiği gibi bir agaroz jeli hazırlayın. PCR ürününü 8.5.1'deki gibi görselleştirmek için jeli çalıştırın: Adım 9'da klonlama için doğru boyutta fragmanlar içeren amplifikasyonları kullanın ve adım 10'da antikorları üretin.
8. Aşağıdakileri içeren 10 μl reaksiyon kullanarak DNA'yı sıralayın: 100 ng 2^nd PCR, 0.2 μM primer veya primer karışımı, 1 μl sonlandırıcı ve 1 μl tampon. Sıralama reaksiyonunu şu koşullar altında gerçekleştirin: (25 döngü: 10 saniye boyunca 96 °C; 5 saniye boyunca 50 °C; ve 4 dakika boyunca 60 °C); 60 °C'de 7 dakika; 4 °C'de soğumaya bırakın.
9. Üreticinin talimatlarını izleyerek sıralama reaksiyonlarını microspin G50 sütunları ile saflaştırın. Ligasyon dizilerini daha önce açıklandığı gibi otomatik bir dizi analizöründe değerlendirin. Elektroferogramlar temiz olmalı ve tek bir immünoglobulin dizisine karşılık gelmelidir.
   NOT: PCR ürünleri belirsiz veya karışık immünoglobulin dizileri gösteriyorsa, izole dizileri elde etmek için lütfen bunları TopoTA sistemini kullanarak klonlamayı düşünün ve ardından 9. adıma geçin.

9. Üreten IgG Klonlarının Ağır ve Hafif Zincirlerinin Klonlanması ve Dizilenmesi

1. pFUSE2ss-CLIg-hk, pFUSE2ss-CLIg-hl2 ve pFUSEss-CHIg-hG1 vektörlerinin 1 μg DNA'sını hazırlayın.
2. Bu vektörleri uygun kısıtlama enzimleri ile sindirin. pFUSE2ss-CLIg-hk için EcoRI ve BsiWI, pFUSE2ss-CLIg-hl2 için EcoRI ve AvrII ve pFUSEss-CHIg-hG1 için EcoRI ve NheI kullanın. 1 μg vektör DNA'sı için her kısıtlama enziminden 3 birim kullanın.
   1. Bir enzim ile sindirin ve sindirilmiş ürünü bir PCR Saflaştırma Kiti ile saflaştırın. İkinci enzim ile sindirin ve bir Jel Ekstraksiyon Kiti ile saflaştırın (üreticinin protokolüne göre). Agaroz jelinden ilgilenilen parçayı kesin. Agaroz jeli adım 8.5'teki gibi hazırlayın.
3. Üreten IgG klonunun 2. PCR ürünlerini sindirin: kappa zincir amplifikasyonu için EcoRI ve BsiWI, lambda zinciri amplifikasyonu için EcoRI ve AvrII ve ağır zincir amplifikasyonu için EcoRI ve NheI. Bir enzim ile sindirin ve sindirilmiş ürünü bir PCR Saflaştırma Kiti ile saflaştırın. İkinci enzim ile sindirin ve sindirilen ürünü bir PCR Saflaştırma Kiti ile saflaştırın. Adım 9.2'deki ile aynı enzim birimlerini ve DNA miktarını kullanın.
4. Vektörlerin içindeki PCR fragmanlarını, üreticinin tavsiyelerine uyarak T4 DNA ligaz 16 °C O/N ile bağlayın. Kullanılan oran 1 : 2 olmalıdır (vektör : insert).
5. DH5α bakterilerini dönüştürmek için 1 μl ligasyon kullanın. Dönüşüm için DH5α üreticisinin koşullarını takip edin. Kullanılan vektörün türüne bağlı olarak bakterileri blasticidin veya zeocin plakalarına yayın. Plakaları O/N 37 °C'de inkübe edin.
6. Tek koloniler büyütün ve üreticinin talimatlarını izleyerek bir mini hazırlık kiti ile DNA'yı çıkarın. Tek koloni büyümesi ve DNA ekstraksiyonu için üreticinin DNA miniprep kitinin önerilerini kullanın. Bunları, adım 9.2 ve 9.3'te olduğu gibi vektörleri ve ekleri hazırlamak için kullanılan enzimlerle sindirerek analiz edin.
7. Adım 8.8 ve 8.9'da yapıldığı gibi 100 ng vektör kullanarak DNA'yı sıralayın.

10. HEK hücrelerinde antikor üretimi

1. %10 fetal buzağı serumu, %1 L-glikoz, %1 penisilin / streptavidin (DMEM +) ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unda (DMEM) HEK hücrelerini 150 mm'lik bir hücre kültürü plakasında %75'lik bir birleşmeye kadar büyütün. 10.1 ila 10.7 arasındaki bir başlık adımında gerçekleştirin.
2. Transfeksiyondan önce, ortamı daha önce olduğu gibi ortama değiştirin, ancak fetal baldır serumu olmadan.
3. Her ağır, hafif zincirli transfeksiyon için, 2.5 ml DMEM (serumsuz), 9 μg ağır zincirli vektör, 6 μg hafif zincirli vektör ve 100 μl polietilenimin (PEI) çözeltisi (1 μg/μl stoktan) içeren bir transfeksiyon karışımı hazırlayın. RT'de 15 dakika inkübe edin.
4. Adım 10.3'te hazırlanan transfeksiyon karışımından 2.5 ml'yi plakadaki HEK hücrelerine yavaşça ekleyin. Homojen bir şekilde dağıtmak için plakayı sallayın.
5. Hücreleri inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO₂ ile 24 saat inkübe edin.
6. Fetal baldır serumu olmadan kültür ortamını orta seviyeye değiştirin.
7. Ortamı 4 gün sonra plakalardan toplayın.
   NOT: Ortamdaki antikorlar, in vitro ve in vivo reaktivitelerini karakterize etmek için kullanılabilir.

Tablo 1. Kullanılan astarlar.

Belediyesi ) ) ) ) )

1st PCR primerleri
	İleri (5'-3')	Ters (3'-5')
IgG	5′ L-VH 1 ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG	3 ′ Cγ CH1 GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC
	5′ L-VH 3 AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG
	5′ L-VH 4/6 CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG
	5′ L-VH 5 CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG
κ	5′ L Vκ 1/2 ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGG	3′ Cκ 543 GTTTCTCGTAGTCTGCTTTGCTCA
5′ L Vκ 3 CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG	3 ′ Cκ 494 GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT
5′ L Vκ 4 ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG
5 ′ Pan Vκ ATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG
λ	5′ L Vλ 1 GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTG	3′ Cλ CACCAGTGGCCTTGTTGGCTTG
5′ L Vλ 2 GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG
5′ L Vλ 3 GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG
5′ L Vλ 4/5 GGTCTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG
5′ L Vλ 6 GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG
5′ L Vλ 7 GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG
5′ L Vλ 8 GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG
2nd PCR primerleri
	İleri (5'-3')	Ters (3'-5')
IgH	5′ EcoRI VH1 CAACCGGAATTCGCAGGTGCAGCTGG TGCAG (TGCAG)	3′ NheI JH 1,2,4,5 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGT GACCAG
	5′ EcoRI VH1 ila 5 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGCAG (Küresel Tarım Ürünleri)	3′ NheI JH 3 CTGCTAGCTAGCTGAGAGACGGTGA CCATTG (CCATTG)
	5 inç EcoRI VH3 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGGAG (İngilizce	3′ NheI JH 6 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGTG ACCGTG
	5′ EcoRI VH3 23 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCT GTTGGAG (İngilizce
	5 inç EcoRI VH4 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCT GCAGGAG (GCAGGAG)
	5′ EcoRI VH 4 34 CAACCGGAATTCAGGTGCAGCAGCTAC AGCAGTG
	5′ EcoRI VH 1 18 CTTCCGGAATTCACAGGTTCAGCT GGTGCAG
	5′ EcoRI VH 1 24 CTTCCGGAATTCACAGGTCCAGCT GGTACAG
	5 inç EcoRI VH3 33 CTTCCGGAATTCACAGGTGCAGCT GGTGGAG (İngilizce
	5′ EcoRIVH 3 9 GATCCGGAATTCAGAAGTGCAGCT GGTGGAG (İngilizce
	5 "EcoRI VH4 39 GATCCGGAATTCACAGCTGCAGCT GCAGGAG (GCAGGAG)
	5′ EcoRI VH 6 1 GATCCGGAATTCACAGGTACTACCT GCAGCAG (GCAGCAG)
κ	5′ EcoRI Vκ 1 5 CAACCGGAATTCAGACATCCAGATGA CCCAGTC (CCCAGTC)	3′ BsiWI Jκ 1 ila 4 GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC
5′ EcoR1 Vκ 1 9 CTTCCGGAATTCAGACATCCAGTTGAC CCAGTCT (Türkçe)	3′ BsiWI Jκ 2 GCCACCGTACGTTTGATCTCCAG CTTGGTC (Türkçe)
5′ EcoR1 Vκ 1D 43 CTTGGCGAATTCAGCCATCCGGATGA CCCAGTC (CCCAGTC)	3′ BsiWI Jκ 3 GCCACCGTACGTTTGATATCCACT TTGGTC (Türkçe)
5′ EcoR1 Vκ 2 24 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATGA CCCAGAC (CCCAGAC)
5′ EcoR1 Vκ 2 28 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATG ACTCAGTC (İngilizce)
5′ EcoR1 Vκ 2 30 CTTCCGGAATTCAGATGTTGTGATGA CTCAGTC (Radyo Teknolojileri Komutanlığı)
5′ EcoR1 Vκ 3 11 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTG ACACAGTC (İngilizce)
5′ EcoR1 Vκ 3 15 CTTCCGGAATTCAGAAATAGTGATG ACGCAGTC
5′ EcoR1 Vκ 3 20 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTGA CGCAGTCT (İngilizce
5′ EcoR1 Vκ 4 1 CTTCCGGAATTCAGACATCGTGATG ACCCAGTC
λ	5′ EcoR1 Vλ 1 CTTCCGGAATTCACAGTCTGTGCTGCT GACKCAG	3′ AvrII Jλ 1 ila 3 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTSACCT TGGTCCC
5′ EcoR1 Vλ 2 CTTCCGGAATTCACAGTCTGCCC TGACTCAG	3′ AvrII Jλ 4 CTGGTTACCTAGGAAAATGATCAGC TGGGTTCC
5′ EcoR1 Vλ 3 CTTCCGGAATTCATCCTATGAGC TGACWCAG	3′ AvrII Jλ 5 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGC TCGGTCCC
5′ EcoR1 Vλ 4 ila 5 CTTCCGGAATTCACAGCYTGTG CTGACTCA (Mücadele Sanatı)	3′ AvrII Jλ 6 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGCT GGGTGCC
5′ EcoR1 Vλ 6 CTTCCGGAATTCAAATTTTATGC TGACTCAG	3′ AvrII Jλ 7 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAC TTGGTCCAT
5′ EcoR1 Vλ 7 ila 8 CTTCCGGAATTCACAGRCTGTG GTGACYCAG (GTGACYCAG)

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Histopak-1077	Sigma-Aldrich	10771	polisakroz ve sodyum diatrizoat içeren çözelti
FACSAria II hücre sıralayıcı	BD Biyolojik Bilimler
96 U-tabanlı mikro kuyu plakası	Yardımcı yıldız	3799
Gelişmiş Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta	Gibco, Yaşam Teknolojileri	12633-020
B95-8 hücre hattının %30 v/v EBV içeren süpernatanı	ATCC (Uzay Servisi)	CRL-1612	3,4 x 108 kopya/ml
CPG2006 Serisi	Canlılık	ODN 7909
Wi38 hücreleri	Sigma-Aldrich	90020107
İnterlökin-2	Roche	10799068001
ELISA plakaları	Greiner Bio-One, Microlon	655092
AffiniPure F(ab')2 Fragmanı Keçi Anti-İnsan IgG, Fcγ Fragmanı Spesifik (Eşleniksiz)	Jackson İmmün Araştırma	109-006-008
%4 yağsız kuru süt (Blotting Grade Blocker)	Biyorad	170-6404
İnsan IgG	Sigma	I 2511	İNSAN IgG saflaştırılmış İmmünoglobulin, 5.6 mg / ml
Keçi F(ab)2 antihuman IgG Fcγ (peroksidaz (PO) ile konjuge)	Jackson İmmün Araştırma	109-036-008
ELISA okuyucu (Perkin Elmer 2030)	Perkin Elmer	2030-0050
Peroksidaz konjuge AffiniPure Tavşan Anti-İnsan IgM, Fc5μ	Jackson İmmün Araştırma	309-035-095
SuperScript III Hücreleri Doğrudan cDNA Sentez Sistemi	Canlandırıcı	18080-200
Uygulamalı Biyosistemler (ABI) GeneAm PCR Sistemi 2700	Uygulamalı Biyosistemler
Yüksek Saflıkta RNA İzolasyon Kiti	Roche	11828665001
Ters transkripsiyon sistemi kiti	Promega	A3500
Rekombinant Taq DNA Polimeraz	Takara	R001A Serisi
Astarlar (2μl)	Sigma
Ultra Saf Agaroz	Canlandırıcı	16500-500
100 bp merdiven	Canlandırıcı	15628-019
Bir Miktar 4.5.2 (Gel Doc 2000)	Biyorad	170-8100
QIAquick PCR saflaştırma kiti	QIAGEN (Türkçe)	28106
BigDye Terminator v3.1 döngü sıralama kiti	Uygulamalı Biyosistemler	4337455
0.1 ml reaksiyon plakası (MicroAMP Optik 96 kuyulu)	Uygulamalı Biyosistemler	4346906
Genetik analizör ABI300	Uygulamalı Biyosistemler	4346906
DH5α yetkin hücreler (E. coli)	Canlandırıcı	18263-012
pFUSEss-CHIg-hG1 (4493 bp)	Canlılık	PFUSESS-HCHG1
pFUSEss-CHIg-hG4 (4484 bp)	Canlılık	pfusess-hchg4
pFUSE2ss-CLIg-hk (3875 bp)	Canlılık	PFUSE2SS-HCLK
pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3883 bp)	Canlılık	PFUSE2SS-HCLL2
SOC ortamı	Canlandırıcı	15544-034
Zeocin (Fast-Media Zeo Agar) ile desteklenmiş LB bazlı agar besiyeri	Canlılık	fas-zn-s
Zeocin (Fast-Media Zeo TB) ile desteklenmiş Müthiş Et Suyu (TB) bazlı sıvı ortam	Canlılık	fas-zn-l
DNA Miniprep kiti	Omega Biyo Teknoloji	D6942-02
Nanodrop (ND1000 Spektrofotometre)	Nano damla
Blasticidin (Fast-Media Blast Agar) ile desteklenmiş LB bazlı agar ortamı	Canlılık	fas-bl-s
Blasticidin (Fast-Media Blast TB) ile desteklenmiş Müthiş Et Suyu (TB) bazlı sıvı ortam	Canlılık	fas-bl-l
EcoRI Teknolojisi	New England Biyolojik Laboratuvarları	R0101S Serisi	20.000 U/ml, 10x NEBuffer EcoRI'da
NheI	New England Biyolojik Laboratuvarları	R0131S	10.000 U/ml, 10x NEBuffer 2.1'de
2-Log DNA merdiveni	New England Biyolojik Laboratuvarları	N3200S Serisi	0.1-10.0 KB, 1.000 μg/ml
Noel	New England Biyolojik Laboratuvarları	R0180S Serisi	10.000 U/ml, 10x CutSmart Tamponda
BsiWI Bilişim Teknolojileri	New England Biyolojik Laboratuvarları	R0553S Serisi	10.000 U/ml, 10x NEBuffer 3.1'de
AvrII	New England Biyolojik Laboratuvarları	R0174S Serisi	5.000 U/ml, 10x CutSmart Tamponda
FastAP Isıya Duyarlı Alkalin Fosfataz	Termo Bilimsel	EF0651	1 U/μL, 10x FastAP Tamponunda
DH5α yetkin hücreler	Canlandırıcı	18263-012
PE Fare Anti-İnsan IgG	BD Pharmingen	555787
anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Klon: HIB22	Balıkçı bilimsel	BDB563942
QIAprep Spin Mini Hazırlık Kiti	QIAGEN (Türkçe)	27106
BigDye Sonlandırıcı v3.1	Uygulamalı Biyosistemler	4337455

Gazetesi Serisi Gazetesi arası Fuar Serisi arası arası Serisi Serisi Serisi